復合物I（NADH:泛醌氧化還原酶）是細胞內(nèi)最大的膜蛋白復合物之一，也是呼吸鏈中構(gòu)成最為復雜的多亞基復合物，且越高等生物的復合物I的構(gòu)成越復雜。復合物I包含14個從原核生物到高等哺乳動物都非常保守的核心亞基，這些亞基相互作用排列呈L形。分布在線粒體基質(zhì)一側(cè)的7個親水核心亞基由細胞核基因編碼，行使NADH脫氫酶的功能，一次催化反應(yīng)中可以從NADH獲得2個電子，通過由1個FMN和7個鐵硫簇組成的電子傳遞載體鏈傳遞給輔酶Q將其還原為QH₂。另外7個核心亞基為跨膜疏水亞基，在真核生物中由線粒體基因組編碼，包含4個與反向轉(zhuǎn)運體結(jié)構(gòu)類似的質(zhì)子泵，一次催化反應(yīng)中可以偶聯(lián)輔酶Q氧化還原反應(yīng)釋放的能量轉(zhuǎn)運4個質(zhì)子到線粒體膜間隙，使得線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成質(zhì)子濃度梯度用于驅(qū)動ATP合酶合成ATP及熱量。除了這14個核心亞基，哺乳動物復合物I還包含31個附屬亞基，用于復合物I的組裝、穩(wěn)定以及活性調(diào)節(jié)。在哺乳動物線粒體中大約有90%的復合物I以超級復合物的形式存在（其它約10%可能是未完全組裝的復合物I）。

復合物I 作為電子進入呼吸鏈的起始點，在整個氧化磷酸化反應(yīng)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其功能障礙會引起細胞呼吸作用至少40%的衰減，進而導致多種疾病，諸如阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、嗜酸細胞型腺瘤、遺傳性視神經(jīng)病變、嬰兒致死性線粒體病、Leigh綜合征、糖尿病以及肥厚型心肌病等。因此線粒體復合物I的結(jié)構(gòu)與催化機理研究顯得尤為重要。由于線粒體復合物I的構(gòu)成復雜，關(guān)于其工作機理一直沒有非常準確的理論。目前比較被大家認可的工作模型是“單Q”模型，即復合物I在一次催化反應(yīng)中結(jié)合/解離一個輔酶Q分子，其還原產(chǎn)生的QH₂需要和溶解在線粒體內(nèi)膜的氧化型輔酶Q進行交換以完成下一次催化。而復合物I中靠近N2鐵硫簇的輔酶Q結(jié)合位點被認為是偶聯(lián)氧化還原反應(yīng)與質(zhì)子轉(zhuǎn)運的位點，但從來沒有研究組觀察到該位點結(jié)合內(nèi)源輔酶Q的結(jié)構(gòu)【6-8】。

在此次發(fā)表的研究論文中，楊教授研究組解析了復合物I與內(nèi)源輔酶Q10、復合物I與Q10-NADH、復合物I與DQ-NADH、復合物I與Q1-NADH、復合物I與經(jīng)典抑制劑魚藤酮，以及復合物I與魚藤酮-NADH這六種結(jié)構(gòu)，最高分辨率高達2.38埃，在復合物I中尤其是其跨膜區(qū)內(nèi)部鑒定到大量的水分子參與質(zhì)子的轉(zhuǎn)運。通過對結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動物復合物I主要存在“活性”和“失活”兩種構(gòu)象狀態(tài)。因為采用了溫和的蛋白純化方法，不僅首次觀察到了內(nèi)源輔酶Q10位于靠近N2鐵硫簇位點的復合物I的結(jié)構(gòu)，并且“活性”構(gòu)象狀態(tài)的復合物I占比高達57%-66%，遠高于其他課題組的0%-12%。而后進一步分析發(fā)現(xiàn)，失活態(tài)不具有參與催化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是一種所謂的休眠狀態(tài)；只有活性態(tài)復合物I參與到催化反應(yīng)中的，且極其微小的構(gòu)象變化就可以完成對輔酶Q10的還原，保證了復合物I可以以400次/秒的催化速率進行反應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)否定了之前其他研究組認為的復合物I催化是通過“活性”和“失活”兩種構(gòu)象狀態(tài)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)的【7】。

研究人員發(fā)現(xiàn)在復合物I的輔酶Q反應(yīng)腔中始終結(jié)合著一個不解離的輔酶Q10分子，并在其內(nèi)部鑒定到了四個輔酶Q10結(jié)合位點，分別是：位點1、位點1F、位點2和位點3。位點1是輔酶Q10被還原的位點；位點1F可以結(jié)合一個翻轉(zhuǎn)的、短鏈的輔酶Q1，同樣也具有結(jié)合輔酶Q10的能力；位點2包含大量的極性氨基酸，可以結(jié)合氧化態(tài)或還原態(tài)的輔酶Q10；位點3靠近輔酶Q反應(yīng)腔出口位置，只在失活態(tài)的復合物I中可以觀察到。此外，還在活性態(tài)復合物I 的NDUFA9亞基C端結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)了一個輔酶Q10的結(jié)合位點，該位點可以“感知”分布在線粒體內(nèi)膜中輔酶Q10的多少，并可以通過一個新鑒定的、位于復合物I內(nèi)部的氫鍵網(wǎng)絡(luò)來影響和調(diào)節(jié)復合物I的活性狀態(tài)進而影響線粒體的能量代謝過程。

研究人員還發(fā)現(xiàn)發(fā)生在位點1的輔酶Q10的還原反應(yīng)并不能引起復合物I跨膜區(qū)的構(gòu)象變化，位點1不是像之前大家認為的是復合物I偶聯(lián)氧化還原反應(yīng)與質(zhì)子轉(zhuǎn)運的位點；含大量的極性氨基酸的位點2才是最有可能的將氧化還原反應(yīng)與質(zhì)子轉(zhuǎn)運相偶聯(lián)的位點?；钚詰B(tài)的復合物I在發(fā)揮催化功能時需要兩個輔酶Q10相互協(xié)同來發(fā)揮功能，具體工作機理詳見圖1。該研究工作揭示了線粒體復合物I全新催化機理，顛覆了人們對高等生物復合物I催化機理的認知，為復合物I的功能研究提供了詳實的結(jié)構(gòu)實驗數(shù)據(jù)支持，并為靶向復合物I的小分子藥物設(shè)計提供了實驗基礎(chǔ)和新的思路。

楊茂君教授研究組長期致力于線粒體呼吸鏈蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究以及相關(guān)靶向藥物的開發(fā)，此前在Nature(2012)、PCCP(2017)和JMC(2017)等雜志連續(xù)報道了II型線粒體復合物I（NDH-2）的詳細電子傳遞機制，同時開發(fā)了以瘧原蟲NDH-2為靶標的針對耐藥性瘧原蟲的新型抗瘧疾藥物前體分子，為開發(fā)新的治療瘧疾的藥物打下了良好的基礎(chǔ)。楊茂君教授研究團隊將再接再厲對線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)進行更加深入的研究，并將致力于研發(fā)治療線粒體異常疾病的新型靶向藥物。

清華大學生命科學學院谷金科（博士后，現(xiàn)為深圳大學醫(yī)學部特聘教授）、劉天涯（16級博士生）、郭潤域（結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者、清華大學水木學者）、張來幸（博士后）是此篇論文的共同第一作者。