胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，因其極高的致死率被稱為癌癥之王，80%~90%的胰腺癌是胰腺導(dǎo)管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）。由于胰腺是消化器官，且胰腺癌早期診斷非常困難、惡性程度高、手術(shù)切除率低、預(yù)后差，因此胰腺癌的臨床取樣相比于其他癌癥更加困難，尤其是同一個(gè)病人很難取到腫瘤組織與正常組織的配對(duì)樣品。以往基于全基因組分析的研究揭示了胰腺癌腫瘤組織的重要基因突變以及DNA甲基化的異常變化，說明胰腺癌的發(fā)生具有極其復(fù)雜的分子機(jī)制。近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究也揭示了胰腺癌腫瘤組織的高度異質(zhì)性，然而胰腺癌腫瘤細(xì)胞的表觀基因組特征還沒有被系統(tǒng)地研究過。

為了全面揭示胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞的分子特征，北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授課題組與天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院郝繼輝教授課題組合作，對(duì)13例胰腺導(dǎo)管腺癌病人的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了高精度單細(xì)胞多組學(xué)測序分析，系統(tǒng)解析了腫瘤細(xì)胞表觀基因組（DNA甲基化組和染色質(zhì)狀態(tài)組）和轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵特征及調(diào)控關(guān)系（圖1）。相關(guān)研究成果于2022年2月15日以研究論文形式在線發(fā)表于Cell Discovery，題為“Integrated single cell multiomics analysis reveals novel candidate markers for prognosis in human pancreatic ductal adenocarcinoma”。

圖1. 胰腺導(dǎo)管腺癌取樣方法及研究思路示意圖

該研究的主要發(fā)現(xiàn)有：

（1）胰腺導(dǎo)管腺癌原發(fā)腫瘤組織中存在較高比例的正常胰腺上皮細(xì)胞，為研究腫瘤細(xì)胞特征提供了精準(zhǔn)對(duì)照。

在該研究中，研究人員對(duì)該實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，磁珠分離單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之后，利用STRT-seq對(duì)細(xì)胞質(zhì)部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，用scCOOL-seq對(duì)細(xì)胞核部分進(jìn)行測序，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測單個(gè)細(xì)胞中的基因表達(dá)、基因組拷貝數(shù)變異、DNA甲基化以及染色質(zhì)可及性狀態(tài)。研究人員通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出胰腺上皮細(xì)胞，并根據(jù)拷貝數(shù)變異情況進(jìn)一步區(qū)分腫瘤上皮細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)腫瘤組織中存在染色體倍性正常的胰腺上皮細(xì)胞，進(jìn)一步分析表明它們的DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)與來自癌旁組織的正常上皮細(xì)胞非常相似（圖2）。這些天然存在于腫瘤組織中的正常上皮細(xì)胞可以作為研究腫瘤細(xì)胞分子特征的精準(zhǔn)對(duì)照，解決了胰腺癌配對(duì)對(duì)照樣品難以獲得的困難。此外，胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞的DNA甲基化水平普遍低于正常上皮細(xì)胞，降低幅度為5%~20%，與結(jié)直腸癌（7%~36%）有所不同。

圖2. 胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞的DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)特征

（2）胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞中，數(shù)百個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化發(fā)生強(qiáng)烈上調(diào)，相應(yīng)的染色質(zhì)從開放狀態(tài)變?yōu)殛P(guān)閉狀態(tài)，并在所有病人中呈現(xiàn)高度的一致性。這些結(jié)果提示使用DNA甲基化抑制劑重新激活這些在不同病人中普遍被DNA甲基化沉默的基因很可能有助于胰腺導(dǎo)管腺癌的治療。

雖然胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤上皮細(xì)胞的整體DNA甲基化水平降低，但是基因啟動(dòng)子區(qū)域的差異甲基化分析結(jié)果顯示，在腫瘤細(xì)胞中，基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化上調(diào)的基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于下調(diào)的基因數(shù)目（圖3），說明在胰腺導(dǎo)管腺癌中有更多的基因由于啟動(dòng)子甲基化上調(diào)而被沉默表達(dá)。在不同腫瘤病人中，上調(diào)啟動(dòng)子甲基化的基因呈現(xiàn)高度的一致性，基因功能注釋分析表明這些基因主要與神經(jīng)系統(tǒng)功能、細(xì)胞命運(yùn)和形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程有關(guān)，提示這些基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中很可能發(fā)揮了重要作用。以上這些結(jié)果提示，如果使用DNA甲基化抑制劑重新激活這些被普遍沉默的基因，可能會(huì)有助于胰腺導(dǎo)管腺癌的治療。

圖3. 胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞的差異甲基化基因與功能注釋

（3）胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞中，基因啟動(dòng)子的DNA甲基化與相應(yīng)基因的表達(dá)呈現(xiàn)增強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而基因本體（gene body）的DNA甲基化與相應(yīng)基因的表達(dá)呈現(xiàn)增強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，提示DNA甲基化在腫瘤發(fā)生過程中增強(qiáng)了對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

研究人員通過在同一個(gè)單細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組與DNA甲基化組的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，相比于正常上皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的基因本體（gene body）的DNA甲基化與RNA表達(dá)量呈現(xiàn)更強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系（圖4），并且，RNA表達(dá)量更低的基因，他們的基因本體去甲基化程度也更劇烈。除此之外，腫瘤細(xì)胞中基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化與RNA表達(dá)量呈現(xiàn)更強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果說明DNA甲基化在腫瘤發(fā)生過程中增強(qiáng)了對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

圖4. 胰腺導(dǎo)管腺癌基因甲基化與相應(yīng)基因表達(dá)量之間的相關(guān)性

（4）胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞的全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化強(qiáng)烈富集在異染色質(zhì)區(qū)域，說明異染色質(zhì)失穩(wěn)是胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤發(fā)生過程的重要分子特征。

與正常上皮細(xì)胞相比，不同患者的胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷了不同程度的全基因組規(guī)模的DNA去甲基化（P05病人除外）。研究人員發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞全基因組水平的去甲基化主要富集在異染色質(zhì)區(qū)域，比如占基因組17%的重復(fù)元件Long interspersed element-1 （LINE-1）（圖5）。然而，CpG島、基因啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域在腫瘤細(xì)胞中的DNA甲基化水平卻高于正常上皮細(xì)胞。研究人員還發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的DNA去甲基化水平與LINE-1的密度呈正相關(guān)，但與H3K4me3、H3K27Ac和H3K36me3的密度呈負(fù)相關(guān)，這也表明胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞的DNA去甲基化在異染色質(zhì)區(qū)域（LINE-1富集區(qū)域）強(qiáng)烈富集，而不是常染色質(zhì)區(qū)域（H3K4me3、H3K27Ac或H3K36me3標(biāo)記區(qū)域）。這些結(jié)果表明，胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤發(fā)生可能涉及異染色質(zhì)區(qū)域的表觀遺傳狀態(tài)紊亂，包括普遍存在的DNA去甲基化過程，與之前的研究的結(jié)直腸癌結(jié)果類似。

圖5. 胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞的基因組去甲基化富集在異染色質(zhì)區(qū)域

（5）聯(lián)合多組學(xué)分析揭示出以FOSL2（功能增強(qiáng)）、ASCL1（功能減弱）為代表的胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

研究人員將染色質(zhì)開放程度與基因表達(dá)水平進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)狀態(tài)與基因表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（圖6）。在腫瘤細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞中分別鑒定出了64339和47622個(gè)染色質(zhì)開放區(qū)域，其中約30%的區(qū)域是腫瘤細(xì)胞特異性的。通過對(duì)各自特異的開放區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列富集分析，研究者鑒定出了胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞特異性富集的轉(zhuǎn)錄因子家族，比如FOSL2基因，它在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)更高的表達(dá)水平和調(diào)控活性，并且其表達(dá)水平越高指示更差的預(yù)后，表明其調(diào)控活性增強(qiáng)在胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤發(fā)生過程中很可能發(fā)揮了重要作用。而與此相反，神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如ASCL1，顯著富集在正常上皮細(xì)胞中，在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)更低的表達(dá)水平和調(diào)控活性，并且其表達(dá)水平越低指示更差的預(yù)后，表明其調(diào)控活性降低在胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤發(fā)生過程中很可能發(fā)揮了重要作用。

圖6. 胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞特異的染色質(zhì)開放區(qū)域以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列富集分析

（6）通過DNA甲基化組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析篩選出以ZNF667和ZNF667-AS1為代表的胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后候選標(biāo)志物。

通過DNA甲基化與基因表達(dá)的聯(lián)合分析，研究人員找到了77個(gè)候選的胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后診斷分子標(biāo)記的差異甲基化基因。其中，ZNF667和ZNF667-AS1是在喉鱗癌以及非小細(xì)胞肺癌等癌癥中被報(bào)道過的標(biāo)記分子。研究者通過對(duì)98例PDAC病人腫瘤組織的ZNF667蛋白定量分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ZNF667蛋白的病人具有顯著更長的生存時(shí)間。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)在多種胰腺癌細(xì)胞系中分別過量表達(dá)ZNF667和ZNF667-AS1基因均能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但不影響腫瘤細(xì)胞凋亡，說明這兩個(gè)基因主要是通過抑制細(xì)胞增殖來抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤發(fā)生。

圖7. 生物信息學(xué)分析與功能驗(yàn)證揭示ZNF667和ZNF667-AS1為胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后候選標(biāo)志物

綜上所述，該研究利用高精度的單細(xì)胞多組學(xué)測序分析，深度解析了胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞不同組學(xué)維度的分子特征及其相互關(guān)系，并且通過不同病人腫瘤細(xì)胞共同變化的分子特征鑒定出一系列以FOSL2、ASCL1、ZNF667和ZNF667-AS1為代表的胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后診斷的潛在分子標(biāo)記，為胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷和治療提供了參考方案。

廣州實(shí)驗(yàn)室范小英研究員、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生陸平、天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院王宏偉博士、南京醫(yī)科大學(xué)卞舒惠研究員和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)吳興龍副教授為該論文的并列第一作者。湯富酬與郝繼輝為該論文的共同通訊作者。該研究項(xiàng)目得到國家自然科學(xué)基金委、北京市科技委和北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心支持。

來源：北京大學(xué)