2月22日，中國科學院上海巴斯德研究所酒亞明課題組在PNAS上，發(fā)表了題為Host cytoskeletal vimentin serves as a structural organizer and an RNA-binding protein regulator to facilitate Zika viral replication的論文。該研究利用多種顯微成像技術和組學分析，首次闡述了中間絲波形蛋白vimentin在寨卡病毒感染中的物理空間支撐與生物功能調控的雙重作用。

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是帶包膜的單鏈正義RNA的黃病毒屬病毒，該病毒導致新生兒小頭畸形、格林-巴利綜合征等神經型疾病。ZIKV進入胞內后會在內質網膜復制，產生大量雙鏈RNA、病毒基因組RNA和病毒蛋白，這些病毒組分和被劫持的宿主因子一起在核周聚集形成病毒復制工廠以提供高效的病毒復制，而該過程中發(fā)生劇烈重構的宿主細胞骨架發(fā)揮怎樣的生物功能尚不清楚。

細胞骨架包括微絲、微管和中間絲，三者互相交織形成網絡為細胞內提供機械支撐，參與細胞器定位、物質運輸、信號傳導等重要生物過程。波形蛋白（vimentin filaments）屬于細胞骨架中間絲，主要圍繞細胞核向細胞邊緣輻射狀分布。近年來，有研究發(fā)現vimentin filaments在病毒感染中會發(fā)生重構向核周聚集，但其在ZIKV感染過程中的動態(tài)變化及其生物功能尚不清楚。此外，細胞骨架蛋白還可參與調節(jié)胞內轉錄翻譯機器。然而，中間絲vimentin與胞內轉錄翻譯機器之間的物理空間和生物功能上的關系尚不清晰，尤其在病毒感染情況下，vimentin filaments與病毒復制工廠形成的聯(lián)系完全未知。

研究利用共聚焦顯微鏡、活細胞實時觀察、超高分辨率顯微鏡和電鏡等生物成像技術，觀察到隨著ZIKV感染時間的延長，細胞內vimentin filaments逐漸向核周聚集，形成籠狀結構以包裹病毒復制工廠組分如dsRNA、NS4B和Env（圖1），內源表達病毒蛋白Env也能誘導vimentin filaments產生類似的現象。

以往研究報道了vimentin filaments在多種病毒感染中均會出現類似重構現象，為了進一步探究這一變化的具體意義和機制，科研人員利用CRISPR/Cas9技術敲除人骨肉瘤細胞系U2OS和人肝癌細胞系Huh7中的vimentin后，發(fā)現病毒復制工廠組分NS4B、Env或dsRNA的胞內定位由核周聚集變?yōu)槌识鄩K分散，并使病毒RNA復制、蛋白合成、子代病毒產生量和整體感染率均顯著降低。只有在敲除細胞中回補全長vimentin才能使病毒復制工廠在被vimentin filaments的包裹下重新向核周聚集成團，回補只能形成八聚體（unit length of filaments，ULF）不能成絲的vimentin不能挽救其分散表型。研究發(fā)現，ZIKV感染后細胞內另一中間絲巢蛋白（nestin filaments）和波形蛋白一起發(fā)生了向病毒復制工廠聚集的變構，但單敲除nestin基因并不影響ZIKV的復制，而單敲除vimentin影響nestin的表達與病毒復制工廠的定位。結果表明，vimentin保證了ZIKV復制工廠的高密度核周聚集，是病毒高效感染的必要條件，且其功能在細胞多種中間絲中具備獨特型和重要性。

為了探索vimentin具體影響了ZIKV病毒感染的哪些步驟，研究人員在野生型和vimentin敲除細胞系中展開了不同感染時間點實驗，以及病毒結合/進入細胞實驗，結果發(fā)現敲除vimentin不影響ZIKV結合或進入細胞，卻使病毒蛋白積累量持續(xù)低于野生型細胞。為了辨別這種病毒蛋白的降低是合成減少還是降解增加，研究分別在兩種細胞內過表達病毒Env-EGFP和NS4B-EGFP蛋白，并分別用蛋白合成抑制劑cyclohemide（CHX）、蛋白酶體抑制劑MG132、溶酶體抑制劑NH4Cl處理，發(fā)現vimentin影響病毒蛋白合成而非降解。

vimentin filaments正常情況下和ZIKV感染情況下的細胞內定位與內質網高度重合，且敲除vimentin使內質網分布更加擴散，這提示vimenitn和內質網之間存在重要聯(lián)系。研究利用質譜結果進行蛋白質組學分析發(fā)現胞內vimentin和大量位于內質網的RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）存在互作。進一步RNA測序組學分析發(fā)現，相對于野生型細胞，vimentin敲除細胞感染病毒后大量內質網相關的具備雙鏈RNA結合功能和轉錄調節(jié)功能的基因表達發(fā)生顯著下調，這進一步印證了vimentin參與寨卡病毒RNA復制過程。綜合兩種組學分析結果，研究聚焦于內質網上一跨膜蛋白核糖體結合蛋白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1），并利用蛋白質體外結合實驗（pull-down assay）驗證了vimentin和RRBP1相互作用。2019年，有研究報道了RRBP1能直接結合病毒RNA從而幫助黃病毒復制，缺失RRBP1基因使胞內寨卡病毒RNA水平下降約40%。為了剖析vimentin和RRBP1分子在ZIKV感染中的關系，研究在野生型細胞和vimentin敲除細胞中分別敲低RRBP1基因表達，觀察兩者胞內表達和定位情況，并對比ZIKV在其中的感染情況。結果發(fā)現，缺失vimentin使RRBP1在mRNA和蛋白質水平均下降約50%，且RRBP1和內質網信號在胞內定位更加分散，出現了類似病毒復制工廠分散的現象；RRBP1與內質網共定位關系不變，但RRBP1與ZIKV dsRNA共定位水平顯著下降。這說明vimentin對于ZIKV感染后內質網的精細變構發(fā)揮重要作用，使病毒復制工廠保持致密結構，并聚集其余宿主分子如參與病毒轉錄翻譯的ER相關蛋白使其保持高效復制。反之，RRBP1敲低卻不影響vimentin的轉錄翻譯水平和胞內定位。單獨敲除vimentin使病毒復制下降的水平遠大于單獨敲除RRBP1，且和雙敲除的抑制效率類似，這表明vimentin或作為RRBP1上游分子調控其參與病毒RNA復制過程。

該研究揭示了在受到寨卡病毒感染后，細胞中間絲波形蛋白網絡會逐漸向核周聚集形成籠狀結構包裹病毒復制工廠，匯聚重要的宿主因子和病毒組分，與眾多內質網蛋白互作如RRBP1以促進病毒RNA復制，從而同時在物理空間和生物功能上幫助病毒在胞內形成完整致密的病毒復制工廠以促進病毒產生，這提示vimentin可作為ZIKV感染治療的潛在宿主靶點。

研究工作得到中科院生物物理研究所、分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心及芬蘭Abo Akademi University科研人員的支持。

論文鏈接

圖1.Vimentin filaments圍繞ZIKV病毒蛋白形成籠狀結構

圖2.Vimentin filaments在ZIKV病毒感染過程中作為“結構支撐”和“調節(jié)因子”的雙重功能

來源： 上海巴斯德研究所