2月22日，中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所酒亞明課題組在PNAS上，發(fā)表了題為Host cytoskeletal vimentin serves as a structural organizer and an RNA-binding protein regulator to facilitate Zika viral replication的論文。該研究利用多種顯微成像技術(shù)和組學(xué)分析，首次闡述了中間絲波形蛋白vimentin在寨卡病毒感染中的物理空間支撐與生物功能調(diào)控的雙重作用。

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是帶包膜的單鏈正義RNA的黃病毒屬病毒，該病毒導(dǎo)致新生兒小頭畸形、格林-巴利綜合征等神經(jīng)型疾病。ZIKV進(jìn)入胞內(nèi)后會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜復(fù)制，產(chǎn)生大量雙鏈RNA、病毒基因組RNA和病毒蛋白，這些病毒組分和被劫持的宿主因子一起在核周聚集形成病毒復(fù)制工廠以提供高效的病毒復(fù)制，而該過(guò)程中發(fā)生劇烈重構(gòu)的宿主細(xì)胞骨架發(fā)揮怎樣的生物功能尚不清楚。

細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中間絲，三者互相交織形成網(wǎng)絡(luò)為細(xì)胞內(nèi)提供機(jī)械支撐，參與細(xì)胞器定位、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生物過(guò)程。波形蛋白（vimentin filaments）屬于細(xì)胞骨架中間絲，主要圍繞細(xì)胞核向細(xì)胞邊緣輻射狀分布。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)vimentin filaments在病毒感染中會(huì)發(fā)生重構(gòu)向核周聚集，但其在ZIKV感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及其生物功能尚不清楚。此外，細(xì)胞骨架蛋白還可參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)器。然而，中間絲vimentin與胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)器之間的物理空間和生物功能上的關(guān)系尚不清晰，尤其在病毒感染情況下，vimentin filaments與病毒復(fù)制工廠形成的聯(lián)系完全未知。

研究利用共聚焦顯微鏡、活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察、超高分辨率顯微鏡和電鏡等生物成像技術(shù)，觀察到隨著ZIKV感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)vimentin filaments逐漸向核周聚集，形成籠狀結(jié)構(gòu)以包裹病毒復(fù)制工廠組分如dsRNA、NS4B和Env（圖1），內(nèi)源表達(dá)病毒蛋白Env也能誘導(dǎo)vimentin filaments產(chǎn)生類(lèi)似的現(xiàn)象。

以往研究報(bào)道了vimentin filaments在多種病毒感染中均會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似重構(gòu)現(xiàn)象，為了進(jìn)一步探究這一變化的具體意義和機(jī)制，科研人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和人肝癌細(xì)胞系Huh7中的vimentin后，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制工廠組分NS4B、Env或dsRNA的胞內(nèi)定位由核周聚集變?yōu)槌识鄩K分散，并使病毒RNA復(fù)制、蛋白合成、子代病毒產(chǎn)生量和整體感染率均顯著降低。只有在敲除細(xì)胞中回補(bǔ)全長(zhǎng)vimentin才能使病毒復(fù)制工廠在被vimentin filaments的包裹下重新向核周聚集成團(tuán)，回補(bǔ)只能形成八聚體（unit length of filaments，ULF）不能成絲的vimentin不能挽救其分散表型。研究發(fā)現(xiàn)，ZIKV感染后細(xì)胞內(nèi)另一中間絲巢蛋白（nestin filaments）和波形蛋白一起發(fā)生了向病毒復(fù)制工廠聚集的變構(gòu)，但單敲除nestin基因并不影響ZIKV的復(fù)制，而單敲除vimentin影響n(yōu)estin的表達(dá)與病毒復(fù)制工廠的定位。結(jié)果表明，vimentin保證了ZIKV復(fù)制工廠的高密度核周聚集，是病毒高效感染的必要條件，且其功能在細(xì)胞多種中間絲中具備獨(dú)特型和重要性。

為了探索vimentin具體影響了ZIKV病毒感染的哪些步驟，研究人員在野生型和vimentin敲除細(xì)胞系中展開(kāi)了不同感染時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以及病毒結(jié)合/進(jìn)入細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除vimentin不影響ZIKV結(jié)合或進(jìn)入細(xì)胞，卻使病毒蛋白積累量持續(xù)低于野生型細(xì)胞。為了辨別這種病毒蛋白的降低是合成減少還是降解增加，研究分別在兩種細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)病毒Env-EGFP和NS4B-EGFP蛋白，并分別用蛋白合成抑制劑cyclohemide（CHX）、蛋白酶體抑制劑MG132、溶酶體抑制劑NH4Cl處理，發(fā)現(xiàn)vimentin影響病毒蛋白合成而非降解。

vimentin filaments正常情況下和ZIKV感染情況下的細(xì)胞內(nèi)定位與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度重合，且敲除vimentin使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布更加擴(kuò)散，這提示vimenitn和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在重要聯(lián)系。研究利用質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)vimentin和大量位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）存在互作。進(jìn)一步RNA測(cè)序組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型細(xì)胞，vimentin敲除細(xì)胞感染病毒后大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的具備雙鏈RNA結(jié)合功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的基因表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，這進(jìn)一步印證了vimentin參與寨卡病毒RNA復(fù)制過(guò)程。綜合兩種組學(xué)分析結(jié)果，研究聚焦于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一跨膜蛋白核糖體結(jié)合蛋白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1），并利用蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)（pull-down assay）驗(yàn)證了vimentin和RRBP1相互作用。2019年，有研究報(bào)道了RRBP1能直接結(jié)合病毒RNA從而幫助黃病毒復(fù)制，缺失RRBP1基因使胞內(nèi)寨卡病毒RNA水平下降約40%。為了剖析vimentin和RRBP1分子在ZIKV感染中的關(guān)系，研究在野生型細(xì)胞和vimentin敲除細(xì)胞中分別敲低RRBP1基因表達(dá)，觀察兩者胞內(nèi)表達(dá)和定位情況，并對(duì)比ZIKV在其中的感染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失vimentin使RRBP1在mRNA和蛋白質(zhì)水平均下降約50%，且RRBP1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)在胞內(nèi)定位更加分散，出現(xiàn)了類(lèi)似病毒復(fù)制工廠分散的現(xiàn)象；RRBP1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位關(guān)系不變，但RRBP1與ZIKV dsRNA共定位水平顯著下降。這說(shuō)明vimentin對(duì)于ZIKV感染后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的精細(xì)變構(gòu)發(fā)揮重要作用，使病毒復(fù)制工廠保持致密結(jié)構(gòu)，并聚集其余宿主分子如參與病毒轉(zhuǎn)錄翻譯的ER相關(guān)蛋白使其保持高效復(fù)制。反之，RRBP1敲低卻不影響vimentin的轉(zhuǎn)錄翻譯水平和胞內(nèi)定位。單獨(dú)敲除vimentin使病毒復(fù)制下降的水平遠(yuǎn)大于單獨(dú)敲除RRBP1，且和雙敲除的抑制效率類(lèi)似，這表明vimentin或作為RRBP1上游分子調(diào)控其參與病毒RNA復(fù)制過(guò)程。

該研究揭示了在受到寨卡病毒感染后，細(xì)胞中間絲波形蛋白網(wǎng)絡(luò)會(huì)逐漸向核周聚集形成籠狀結(jié)構(gòu)包裹病毒復(fù)制工廠，匯聚重要的宿主因子和病毒組分，與眾多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白互作如RRBP1以促進(jìn)病毒RNA復(fù)制，從而同時(shí)在物理空間和生物功能上幫助病毒在胞內(nèi)形成完整致密的病毒復(fù)制工廠以促進(jìn)病毒產(chǎn)生，這提示vimentin可作為ZIKV感染治療的潛在宿主靶點(diǎn)。

研究工作得到中科院生物物理研究所、分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心及芬蘭Abo Akademi University科研人員的支持。

論文鏈接

圖1.Vimentin filaments圍繞ZIKV病毒蛋白形成籠狀結(jié)構(gòu)

圖2.Vimentin filaments在ZIKV病毒感染過(guò)程中作為“結(jié)構(gòu)支撐”和“調(diào)節(jié)因子”的雙重功能

來(lái)源： 上海巴斯德研究所