CRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛開發(fā)并應(yīng)用于各類細(xì)胞和組織的遺傳或表觀遺傳編輯，相關(guān)技術(shù)亦被逐步用于農(nóng)業(yè)育種、人類疾病治療及生物能源生產(chǎn)等方面，是未來生物科技發(fā)展的重要領(lǐng)域。但經(jīng)過近十年的研究，僅有Cas9和Cas12a這兩類酶能被用作高效的基因編輯工具。其中，常用的SpyCas9和AsCas12a蛋白分子量大，超過1300個氨基酸，極大地影響了細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和可用于蛋白質(zhì)工程編輯的自由度。另外，許多研究表明，這兩個酶存在較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，而且多種病原微生物中也存在這兩類酶，這些因素都嚴(yán)重阻礙了CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)的體內(nèi)應(yīng)用，尤其是針對人類疾病治療相關(guān)的應(yīng)用。
清華大學(xué)劉俊杰課題組與Jennifer Doudna課題組合作開發(fā)小型、高效基因編輯工具-肽度TIMEDOO
圖1: PlmCasX R-loop復(fù)合物的三種結(jié)構(gòu)狀態(tài)
劉俊杰助理教授長期專注DNA和RNA核酸酶研究及相關(guān)核酸操縱工具的開發(fā)。2019年，劉俊杰及其合作者發(fā)現(xiàn)并鑒定了一類來自于非致病菌的、可用于基因編輯操作的小型（<1000個氨基酸）CRISPR-CasX核酸酶?（Liu J.J. et al., Nature, 2019）。該工作也通過對DpbCasX與gRNA及DNA底物所存在的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)的解析，揭示了CasX如何有效地協(xié)調(diào)多個結(jié)構(gòu)亞基來完成基于單個酶活中心的DNA雙鏈切割的機理，這與Cas9和Cas12a系統(tǒng)截然不同。然而，CasX以及近期其他課題組報道的小型基因編輯工具，如CasPhi, Cas12f 等，基因編輯效率均比較低，限制了它們的廣泛應(yīng)用。

清華大學(xué)劉俊杰課題組與Jennifer Doudna課題組合作開發(fā)小型、高效基因編輯工具-肽度TIMEDOO

圖2: 改造前后的CasX基因編輯效率對比

最新的CasX基因編輯平臺，可對GFP位點產(chǎn)生平均80%左右的編輯效率（A），對測試的內(nèi)源位點可產(chǎn)生最高50%的編輯效率（B）

近期，劉俊杰助理教授課題組與加州大學(xué)Jennifer?doudna課題組合作在Molecular Cell雜志在線發(fā)表題為“Chimeric CRISPR-CasX enzymes and guide RNAs for improved genome editing activity”的研究論文。該工作通過解析PlmCasX與底物的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)，并與DpbCasX對比，解釋了DpbCasX和PlmCasX各異的體內(nèi)外DNA切割活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時，通過對CasX蛋白和sgRNA的結(jié)構(gòu)改造，極大地提高了DpbCasX和PlmCasX的基因編輯效率，在GFP位點上可達90%，在內(nèi)源位點上可達50%。CasX具有分子量?。?80個氨基酸）、基因編輯效率高及非特異性DNA切割活性低等眾多優(yōu)點，有望為基因編輯工具的臨床應(yīng)用提供重要技術(shù)支撐。

清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心劉俊杰助理教授和加州大學(xué)伯克利分校Jennifer?Doudna教授為本文的共同通訊作者，高精尖結(jié)構(gòu)生物學(xué)中心卓越學(xué)者張壽悅、生命學(xué)院博士后趙玉倩、加州大學(xué)伯克利分校博士研究生Connor?Tsuchida?和 Mohammad?Saffarri?Doost為本文的共同第一作者。美國勞倫斯伯克利國家實驗室的Eva?Nogales教授，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院陳曉偉助理教授，以色列特拉維夫大學(xué)的David?Burstein助理教授、清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心薛毅助理教授、方顯揚助理教授也在該工作中給予了大力的支持和幫助。清華大學(xué)冷凍電子顯微鏡平臺和生物醫(yī)學(xué)計算平臺為本課題提供了技術(shù)支持。該研究由國家自然科學(xué)基金委、清華大學(xué)春風(fēng)基金和劉俊杰實驗室啟動經(jīng)費支持。

DOI
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.02.002
50天內(nèi)有效
免費閱讀鏈接
https://authors.elsevier.com/a/1eeoW3vVUPK7Al

來源：結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心