2月22日，中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所酒亞明課題組在國(guó)際期刊PNAS發(fā)表了題為“Host cytoskeletal vimentin serves as a structural organizer and an RNA-binding protein regulator to facilitate Zika viral replication”的文章，該研究利用多種顯微成像技術(shù)和組學(xué)分析，首次闡述了中間絲波形蛋白vimentin在寨卡病毒感染中的物理空間支撐與生物功能調(diào)控的雙重作用。

　　寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是帶包膜的單鏈正義RNA的黃病毒屬病毒，因其感染會(huì)導(dǎo)致新生兒小頭畸形、格林-巴利綜合征等神經(jīng)型疾病而被廣泛關(guān)注（1-4）。ZIKV進(jìn)入胞內(nèi)后會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生大量雙鏈RNA、病毒基因組RNA和病毒蛋白，這些病毒組分和被劫持的宿主因子一起在核周聚集形成病毒復(fù)制工廠(chǎng)以提供高效的病毒復(fù)制（5-7），但是在此過(guò)程中發(fā)生劇烈重構(gòu)的宿主細(xì)胞骨架發(fā)揮怎樣的生物功能尚不清楚。

　　細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中間絲，三者互相交織形成網(wǎng)絡(luò)為細(xì)胞內(nèi)提供機(jī)械支撐，參與細(xì)胞器定位、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生物過(guò)程（8,9）。波形蛋白(vimentin filaments)屬于細(xì)胞骨架中間絲，主要圍繞細(xì)胞核向細(xì)胞邊緣輻射狀分布。近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)vimentin filaments在病毒感染中會(huì)發(fā)生重構(gòu)向核周聚集，但是其在ZIKV感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及其生物功能尚不清楚。除此之外，細(xì)胞骨架蛋白還能參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)器（10）。但是中間絲vimentin與胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)器之間的物理空間和生物功能上的關(guān)系尚不清楚，尤其在病毒感染情況下，vimentin filaments與病毒復(fù)制工廠(chǎng)形成的聯(lián)系完全未知。

　　研究人員首先利用共聚焦顯微鏡、活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀(guān)察、超高分辨率顯微鏡和電鏡等生物成像技術(shù)觀(guān)察到隨著ZIKV感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)vimentin filaments逐漸向核周聚集，形成籠狀結(jié)構(gòu)以包裹病毒復(fù)制工廠(chǎng)組分如dsRNA、NS4B和Env （圖1），內(nèi)源表達(dá)病毒蛋白Env也能誘導(dǎo)vimentin filaments產(chǎn)生類(lèi)似的現(xiàn)象。

　　圖1. Vimentin filaments圍繞ZIKV病毒蛋白形成籠狀結(jié)構(gòu)?

　　之前就有一些文章報(bào)道了vimentin filaments在多種病毒感染中均會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似重構(gòu)現(xiàn)象（11-17），為了進(jìn)一步研究這一變化的具體意義和機(jī)制，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和人肝癌細(xì)胞系Huh7中的vimentin后，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制工廠(chǎng)組分NS4B、Env或dsRNA的胞內(nèi)定位由核周聚集變?yōu)槌识鄩K分散 ，并使病毒RNA復(fù)制、蛋白合成、子代病毒產(chǎn)生量和整體感染率都顯著降低。有趣的是，只有在敲除細(xì)胞中回補(bǔ)全長(zhǎng)vimentin才能使病毒復(fù)制工廠(chǎng)在被vimentin filaments的包裹下重新向核周聚集成團(tuán)，回補(bǔ)只能形成八聚體（unit length of filaments，ULF）不能成絲的vimentin不能挽救其分散表型。除此之外，研究人員發(fā)現(xiàn)ZIKV感染后細(xì)胞內(nèi)另一中間絲巢蛋白（nestin filaments）和波形蛋白一起發(fā)生了向病毒復(fù)制工廠(chǎng)聚集的變構(gòu)，但是單敲除nestin基因并不影響ZIKV的復(fù)制，而單敲除vimentin不僅影響n(yōu)estin的表達(dá)還影響病毒復(fù)制工廠(chǎng)的定位。這些結(jié)果表明vimentin保證了ZIKV復(fù)制工廠(chǎng)的高密度核周聚集，是病毒高效感染的必要條件，并且其功能在細(xì)胞多種中間絲中具備獨(dú)特型和重要性。

　　為了進(jìn)一步研究vimentin具體影響了ZIKV病毒感染的哪些步驟，研究人員在野生型和vimentin敲除細(xì)胞系中做了不同感染時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，和病毒結(jié)合/進(jìn)入細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除vimentin并不影響ZIKV結(jié)合或進(jìn)入細(xì)胞，但會(huì)使病毒蛋白積累量持續(xù)低于野生型細(xì)胞。為了辨別這種病毒蛋白的降低是合成減少還是降解增加，研究人員分別在兩種細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)病毒Env-EGFP和NS4B-EGFP蛋白，并分別用蛋白合成抑制劑cyclohemide (CHX)、蛋白酶體抑制劑MG132、溶酶體抑制劑NH4Cl處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)vimentin影響了病毒蛋白合成而非降解。

　　因?yàn)関imentin filaments正常情況下和ZIKV感染情況下的細(xì)胞內(nèi)定位與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度重合，且敲除vimentin使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布更加擴(kuò)散，提示vimenitn和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在重要聯(lián)系。研究人員利用質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)vimentin和大量位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）存在互作。進(jìn)一步RNA測(cè)序組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型細(xì)胞，vimentin敲除細(xì)胞感染病毒后大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的具備雙鏈RNA結(jié)合功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的基因表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，這些結(jié)果進(jìn)一步印證了vimentin參與寨卡病毒RNA復(fù)制過(guò)程。綜合兩種組學(xué)分析結(jié)果，研究人員將目光聚焦于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一跨膜蛋白核糖體結(jié)合蛋白1（ribosome-binding protein 1, RRBP1），并利用蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)（pull-down assay）驗(yàn)證了vimentin和RRBP1相互作用。在2019年就有文章報(bào)道RRBP1能直接結(jié)合病毒RNA從而幫助黃病毒復(fù)制，缺失RRBP1基因使胞內(nèi)寨卡病毒RNA水平下降約40%（18）。 為了探究vimentin和RRBP1分子在ZIKV感染中的關(guān)系，作者在野生型細(xì)胞和vimentin敲除細(xì)胞中分別敲低RRBP1基因表達(dá)，觀(guān)察兩者胞內(nèi)表達(dá)和定位情況，并對(duì)比ZIKV在其中的感染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失vimentin使RRBP1在mRNA和蛋白質(zhì)水平均下降約50%，且RRBP1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)在胞內(nèi)定位更加分散，出現(xiàn)了類(lèi)似病毒復(fù)制工廠(chǎng)分散的現(xiàn)象，雖然RRBP1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位關(guān)系不變，但RRBP1與ZIKV dsRNA共定位水平顯著下降。這說(shuō)明vimentin對(duì)于ZIKV感染后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的精細(xì)變構(gòu)發(fā)揮重要作用，使病毒復(fù)制工廠(chǎng)保持致密結(jié)構(gòu)，并聚集其余宿主分子如參與病毒轉(zhuǎn)錄翻譯的ER相關(guān)蛋白使其保持高效復(fù)制。反之RRBP1敲低卻不影響vimentin的轉(zhuǎn)錄翻譯水平和胞內(nèi)定位。單獨(dú)敲除vimentin使病毒復(fù)制下降的水平遠(yuǎn)大于單獨(dú)敲除RRBP1，且和雙敲除的抑制效率類(lèi)似，這表明vimentin可能作為RRBP1上游分子調(diào)控其參與病毒RNA復(fù)制過(guò)程。

　　縱觀(guān)整篇文章，這項(xiàng)研究揭示了在受到寨卡病毒感染后，細(xì)胞中間絲波形蛋白網(wǎng)絡(luò)會(huì)逐漸向核周聚集形成籠狀結(jié)構(gòu)包裹病毒復(fù)制工廠(chǎng)，匯聚重要的宿主因子和病毒組分，與眾多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白互作如RRBP1以促進(jìn)病毒RNA復(fù)制，從而同時(shí)在物理空間和生物功能上幫助病毒在胞內(nèi)形成完整致密的病毒復(fù)制工廠(chǎng)以促進(jìn)病毒產(chǎn)生，這提示vimentin可作為ZIKV感染治療的潛在宿主靶點(diǎn)。

　　圖2. Vimentin filaments在ZIKV病毒感染過(guò)程中作為‘結(jié)構(gòu)支撐’和‘調(diào)節(jié)因子’的雙重功能

　　中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所博士生張悅為該文章第一作者；中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所酒亞明研究員、復(fù)旦大學(xué)上海市公共衛(wèi)生臨床中心金俠教授為該文章的共同通訊作者；中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所薛艷紅研究員和中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所崔杰研究員為該文章的樣品制備和數(shù)據(jù)收集提供了支持；該研究也得到了芬蘭 Abo Akademi University的John E. Eriksson教授、中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心的鮑嵐研究員與朱學(xué)良研究員的支持和幫助。

　　【實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介】

　　中科院上海巴斯德研究所酒亞明課題組一直圍繞細(xì)胞骨架調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和病原體感染這兩大類(lèi)疾病研究，優(yōu)化并融合了一系列先進(jìn)光學(xué)成像技術(shù)和病毒細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)體系，從細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病原體宿主互作等多個(gè)角度，深入解析了細(xì)胞骨架與疾病的分子機(jī)理，旨在為癌癥以及相關(guān)感染性疾病的精準(zhǔn)治療提供新理論、藥物靶點(diǎn)和治療策略。酒亞明研究員圍繞上述工作取得一系列重要原創(chuàng)性成果，發(fā)表高水平SCI學(xué)術(shù)論文40余篇，近期研究成果以通訊作者在PNAS, JCB, Current Biology等高水平雜志發(fā)表。作為一支朝氣蓬勃、熱愛(ài)科學(xué)、團(tuán)結(jié)協(xié)作的科研團(tuán)隊(duì)，課題組熱忱歡迎優(yōu)秀的博士后、博士及研究生聯(lián)系加入，聯(lián)系方式y(tǒng)mjiu@ips.ac.cn。

　　原文鏈接：https://www.pnas.org/content/119/8/e2113909119

來(lái)源：中科院