枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為革蘭氏陽(yáng)性菌的模式菌種，具有分泌表達(dá)、異源表達(dá)水平高和生物安全等優(yōu)良特性，廣泛應(yīng)用于淀粉酶、蛋白酶等多種工業(yè)蛋白質(zhì)的表達(dá)和維生素、核苷等重要化學(xué)品的生產(chǎn)中。目前，商業(yè)化枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)匱乏，且表達(dá)強(qiáng)度與大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母細(xì)胞甲醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)差距較大，且存在誘導(dǎo)物毒性、誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴等問(wèn)題，限制了枯草芽孢桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。

中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員張大偉團(tuán)隊(duì)在枯草芽孢桿菌中開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基于麥芽糖轉(zhuǎn)錄激活因子操作子（MalO）的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)MATE（maltose-inducible expression system），實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的高強(qiáng)度、高嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)與調(diào)控。

枯草芽孢桿菌高效蛋白表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建策略及其在途徑調(diào)控、合成生物技術(shù)應(yīng)用研究如下：對(duì)麥芽糖啟動(dòng)子P_malA的操作子序列（MalO）進(jìn)行鑒定、突變和高通量篩選，獲得了一系列具有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子突變體，并對(duì)MalO序列在啟動(dòng)子中的位置和序列進(jìn)行調(diào)整，構(gòu)建出在單細(xì)胞內(nèi)能夠兼容的誘導(dǎo)激活型/抑制型系統(tǒng)MATE-ON/OFF，并運(yùn)用流式細(xì)胞儀證明MATE誘導(dǎo)系統(tǒng)具有高均一性和高重復(fù)性；對(duì)啟動(dòng)子cre元件和宿主細(xì)胞的工程改造，解除了葡萄糖對(duì)系統(tǒng)的CCR抑制效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了20g/L葡萄糖條件下維持原本誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度；加入激活型核糖開(kāi)關(guān)整合轉(zhuǎn)錄-翻譯調(diào)控元件，進(jìn)一步提高系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)性，在保持表達(dá)強(qiáng)度的條件下實(shí)現(xiàn)790倍的誘導(dǎo)倍數(shù)，實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)強(qiáng)度和系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)性的兼得；分析了MalO在不同數(shù)量和距離下對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的影響，通過(guò)改變MalO在啟動(dòng)子中的數(shù)量或位置可實(shí)現(xiàn)對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的減弱或增強(qiáng)，提出了獲得不同梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子元件的新策略，同時(shí)，證實(shí)了MalO作為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子對(duì)其他內(nèi)源啟動(dòng)子的誘導(dǎo)激活作用，并以α-淀粉酶和hFGF21為例驗(yàn)證了MalO增強(qiáng)子在激活分子伴侶、促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)上的應(yīng)用；利用MATE系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了hFGF21、幾丁質(zhì)酶、阿洛酮糖異構(gòu)酶、低聚半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等9個(gè)異源蛋白質(zhì)的高效分泌表達(dá)，胞內(nèi)蛋白平均表達(dá)水平近60%，胞外蛋白平均表達(dá)水平近80%；采用合成生物學(xué)策略，構(gòu)建MATE-on/off開(kāi)關(guān)系統(tǒng)，調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞形態(tài)，可高效調(diào)控合成途徑實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)紫桿菌素等營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品，同時(shí)，證實(shí)了MATE作為基因開(kāi)關(guān)和途徑調(diào)控工具在基因功能研究及合成生物學(xué)中的應(yīng)用能力，為枯草芽孢桿菌提供了新的高效蛋白表達(dá)系統(tǒng)和代謝途徑調(diào)控工具。

相關(guān)研究成果發(fā)表在PNAS上。研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)項(xiàng)目的支持。

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枯草芽孢桿菌高效MATE表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用

來(lái)源：中科院