2022年5月4日，北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心鄧宏魁教授課題組與李程研究員課題組、北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院徐君研究員課題組在Cell Research雜志上發(fā)表了題為“Derivation of totipotent-like stem cells with blastocyst-likestructure forming potential”的研究論文。該研究通過化學小分子篩選組合，建立了一個新的全能性干細胞培養(yǎng)條件，可以支持從小鼠二細胞胚胎及擴展型多能干細胞（EPS細胞）建立全能性干細胞系。這種新型全能性干細胞可在體外長期穩(wěn)定培養(yǎng)，在分子特征和發(fā)育潛能上與小鼠二細胞胚胎高度相似，并且可以在體外被誘導形成在轉(zhuǎn)錄組水平上類似于體內(nèi)囊胚的類囊胚結(jié)構(gòu)。

論文截圖

如何在體外制備全能性干細胞，長期以來一直是干細胞領域的重要科學問題。在小鼠中，只有受精卵及二細胞胚胎具有全能性：單個細胞能夠形成一個完整生命個體。隨后發(fā)育形成的囊胚細胞可以被用于建立多潛能干細胞，滋養(yǎng)層干細胞及原始內(nèi)胚層干細胞。然而，這些干細胞的發(fā)育潛能是受限的，無法同時發(fā)育到胚內(nèi)和胚外組織。近年的研究發(fā)現(xiàn)：在小鼠多能干細胞群中存在極少量的表達小鼠二細胞胚胎分子標記MERVL的細胞，被稱為二細胞樣細胞（2-celllike cells），具有二細胞胚胎的部分分子特征⁽¹⁾。然而，這種細胞無法在體外進行穩(wěn)定的培養(yǎng)。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，二細胞樣細胞與體內(nèi)二細胞胚胎仍存在較大差異，作為體外研究全能性的模型仍存在較大局限性^（2）。

北京大學鄧宏魁團隊長期以來致力于采用化學小分子調(diào)控的手段來建立調(diào)控干細胞的發(fā)育潛能的新方法^（3-6）。2017年鄧宏魁團隊報道了一個新的小分子組合（LCDM），可以在人和小鼠中建立擴展型多能干細胞（EPS細胞）^（4）。EPS細胞具有胚內(nèi)胚外發(fā)育潛能，并且可以被誘導形成類囊胚（Blastoid）結(jié)構(gòu)^（7）。然而，與小鼠二細胞胚胎相比，這種細胞的分子特征與二細胞胚胎還有較大差異，細胞的胚外分化潛能也存在局限性，誘導獲得的類囊胚結(jié)構(gòu)中存在較高比例的中間態(tài)和中胚層樣細胞^（8）。最近北京大學杜鵬團隊、中山大學王繼廠團隊等報道了全能性干細胞的誘導條件^（9-10）。當前，如何直接自小鼠全能性胚胎建立全能性干細胞，仍是全能性干細胞研究的“金標準”。

在本研究中，團隊通過化學小分子高通量篩選，鑒定了能夠在EPS細胞中誘導提高MERVL及Zscan4陽性細胞比例的化學小分子。通過進一步的組合優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了一個可以將EPS細胞誘導為全能性干細胞的小分子組合CD1530，VPA，EPZ004777，CHIR 99021 (CPEC組合)，誘導獲得的全能性干細胞能長期穩(wěn)定地在體外培養(yǎng)。更為重要的是，CPEC組合可以在體外支持從小鼠二細胞胚胎直接建立全能性干細胞系。研究者將由CPEC組合支持建立的全能性干細胞命名為全能潛能干細胞（totipotent potential stem cells, TPS細胞）。

研究者進一步從轉(zhuǎn)錄組、表觀特征、嵌合能力等多個方面深入分析了TPS細胞的分子特征和發(fā)育潛能。他們發(fā)現(xiàn)TPS細胞在單細胞水平上表達大量的全能性特征基因，并且下調(diào)了多能性的分子標記。進一步的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，TPS細胞群中存在一個在轉(zhuǎn)錄組水平與中期二細胞胚胎高度相似的細胞亞群（約10%）。他們定量分析了TPS細胞、杜鵬團隊報道的TBLC中的全能干細胞亞群、二細胞樣細胞與二細胞胚胎的轉(zhuǎn)錄組相似度，發(fā)現(xiàn)TPS細胞中的全能干細胞亞群與二細胞胚胎的相似程度是最高的。ATAC-seq和全基因組甲基化分析也表明：TPS細胞具備了二細胞胚胎的表觀修飾特征。在發(fā)育潛能分析方面，他們通過在不同發(fā)育階段的單細胞嵌合實驗證明了：單個TPS細胞具備了同時向胚內(nèi)和胚外發(fā)育的能力。為了嚴格證明TPS細胞在體內(nèi)的胚外發(fā)育潛能，他們對E17.5的嵌合胎盤進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明TPS來源的細胞可以分化形成多種胚外滋養(yǎng)層細胞類型。并且，他們發(fā)現(xiàn)tdTomato標記的TPS細胞與有GFP標記的受體胚胎形成的嵌合胎盤中，存在大量的tdTomato單陽性嵌合細胞，高表達滋養(yǎng)層細胞的分子標記，排除了由細胞融合導致的假陽性可能。這些結(jié)果表明了TPS細胞具備了與二細胞胚胎相似的分子特征和發(fā)育潛能。

自組裝形成類囊胚結(jié)構(gòu)的能力是評估細胞全能性最為關鍵的功能性標準之一。研究者證明了通過調(diào)控早期胚胎發(fā)育的信號通路，可誘導TPS細胞高效形成類囊胚結(jié)構(gòu)。單細胞轉(zhuǎn)錄組分析表明，TPS誘導的類囊胚結(jié)構(gòu)中存在與小鼠E4.5囊胚中類似的上胚層、滋養(yǎng)外胚層、原始內(nèi)胚層細胞，并且在轉(zhuǎn)錄組水平上高度相似。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的定量分析，研究者進一步比較了TPS-類囊胚結(jié)構(gòu)中的滋養(yǎng)層細胞、小鼠滋養(yǎng)層干細胞/多能干細胞組合誘導類囊胚中的滋養(yǎng)層細胞，發(fā)現(xiàn)TPS-類囊胚結(jié)構(gòu)中的滋養(yǎng)層細胞更類似于著床前囊胚中的小鼠滋養(yǎng)外胚層細胞。并且，不同于EPS細胞誘導的類囊胚結(jié)構(gòu)，TPS-類囊胚結(jié)構(gòu)中并不存在大量的中間態(tài)細胞及中胚層樣細胞。將TPS來源的類囊胚結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)后，可以誘導蛻膜化反應，但是仍無法像正常囊胚那樣發(fā)育成個體，提示誘導類囊胚的方案仍需優(yōu)化。

最后，研究者分析了CPEC組合在TPS細胞中誘導和調(diào)控全能性的分子機制。他們發(fā)現(xiàn)抑制HDAC1/2和Dot1L的活性、以及特異激活RARγ通路，對TPS細胞的誘導和維持具有重要作用。有趣的是，當用CPEC組合的小分子聯(lián)合處理小鼠二細胞胚胎時，他們發(fā)現(xiàn)這些小分子處理能在一定程度上幫助維持小鼠胚胎中的全能性分子標記的表達。這些結(jié)果表明HDAC1/2、Dot1L、RARγ通路的協(xié)同調(diào)控對于小鼠全能性調(diào)控的重要作用。

綜上所述，該研究利用化學調(diào)控的方法從小鼠二細胞胚胎中建立了新型的全能性干細胞，該細胞具有與二細胞胚胎相似的分子特征及雙向發(fā)育潛能，能夠形成與體內(nèi)著床前囊胚更相似的類囊胚結(jié)構(gòu)。這一工作不僅為體外研究全能性提供了更為合適和可靠的模型，而且朝著在不同哺乳動物物種中利用全能性胚胎捕捉、維持全能性干細胞的目標邁出了重要的一步。

鄧宏魁、李程、徐君是論文的共同通訊作者。北京大學徐亞星、趙晶薷、任奕璇、王旭陽和呂鈺麟為第一作者。本工作獲得了北大-清華生命科學聯(lián)合中心、國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金等支持。

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來源：北京大學