2022年5月4日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心鄧宏魁教授課題組與李程研究員課題組、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院徐君研究員課題組在Cell Research雜志上發(fā)表了題為“Derivation of totipotent-like stem cells with blastocyst-likestructure forming potential”的研究論文。該研究通過化學(xué)小分子篩選組合，建立了一個(gè)新的全能性干細(xì)胞培養(yǎng)條件，可以支持從小鼠二細(xì)胞胚胎及擴(kuò)展型多能干細(xì)胞（EPS細(xì)胞）建立全能性干細(xì)胞系。這種新型全能性干細(xì)胞可在體外長期穩(wěn)定培養(yǎng)，在分子特征和發(fā)育潛能上與小鼠二細(xì)胞胚胎高度相似，并且可以在體外被誘導(dǎo)形成在轉(zhuǎn)錄組水平上類似于體內(nèi)囊胚的類囊胚結(jié)構(gòu)。

論文截圖

如何在體外制備全能性干細(xì)胞，長期以來一直是干細(xì)胞領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。在小鼠中，只有受精卵及二細(xì)胞胚胎具有全能性：單個(gè)細(xì)胞能夠形成一個(gè)完整生命個(gè)體。隨后發(fā)育形成的囊胚細(xì)胞可以被用于建立多潛能干細(xì)胞，滋養(yǎng)層干細(xì)胞及原始內(nèi)胚層干細(xì)胞。然而，這些干細(xì)胞的發(fā)育潛能是受限的，無法同時(shí)發(fā)育到胚內(nèi)和胚外組織。近年的研究發(fā)現(xiàn)：在小鼠多能干細(xì)胞群中存在極少量的表達(dá)小鼠二細(xì)胞胚胎分子標(biāo)記MERVL的細(xì)胞，被稱為二細(xì)胞樣細(xì)胞（2-celllike cells），具有二細(xì)胞胚胎的部分分子特征⁽¹⁾。然而，這種細(xì)胞無法在體外進(jìn)行穩(wěn)定的培養(yǎng)。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，二細(xì)胞樣細(xì)胞與體內(nèi)二細(xì)胞胚胎仍存在較大差異，作為體外研究全能性的模型仍存在較大局限性^（2）。

北京大學(xué)鄧宏魁團(tuán)隊(duì)長期以來致力于采用化學(xué)小分子調(diào)控的手段來建立調(diào)控干細(xì)胞的發(fā)育潛能的新方法^（3-6）。2017年鄧宏魁團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一個(gè)新的小分子組合（LCDM），可以在人和小鼠中建立擴(kuò)展型多能干細(xì)胞（EPS細(xì)胞）^（4）。EPS細(xì)胞具有胚內(nèi)胚外發(fā)育潛能，并且可以被誘導(dǎo)形成類囊胚（Blastoid）結(jié)構(gòu)^（7）。然而，與小鼠二細(xì)胞胚胎相比，這種細(xì)胞的分子特征與二細(xì)胞胚胎還有較大差異，細(xì)胞的胚外分化潛能也存在局限性，誘導(dǎo)獲得的類囊胚結(jié)構(gòu)中存在較高比例的中間態(tài)和中胚層樣細(xì)胞^（8）。最近北京大學(xué)杜鵬團(tuán)隊(duì)、中山大學(xué)王繼廠團(tuán)隊(duì)等報(bào)道了全能性干細(xì)胞的誘導(dǎo)條件^（9-10）。當(dāng)前，如何直接自小鼠全能性胚胎建立全能性干細(xì)胞，仍是全能性干細(xì)胞研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

在本研究中，團(tuán)隊(duì)通過化學(xué)小分子高通量篩選，鑒定了能夠在EPS細(xì)胞中誘導(dǎo)提高M(jìn)ERVL及Zscan4陽性細(xì)胞比例的化學(xué)小分子。通過進(jìn)一步的組合優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以將EPS細(xì)胞誘導(dǎo)為全能性干細(xì)胞的小分子組合CD1530，VPA，EPZ004777，CHIR 99021 (CPEC組合)，誘導(dǎo)獲得的全能性干細(xì)胞能長期穩(wěn)定地在體外培養(yǎng)。更為重要的是，CPEC組合可以在體外支持從小鼠二細(xì)胞胚胎直接建立全能性干細(xì)胞系。研究者將由CPEC組合支持建立的全能性干細(xì)胞命名為全能潛能干細(xì)胞（totipotent potential stem cells, TPS細(xì)胞）。

研究者進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄組、表觀特征、嵌合能力等多個(gè)方面深入分析了TPS細(xì)胞的分子特征和發(fā)育潛能。他們發(fā)現(xiàn)TPS細(xì)胞在單細(xì)胞水平上表達(dá)大量的全能性特征基因，并且下調(diào)了多能性的分子標(biāo)記。進(jìn)一步的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，TPS細(xì)胞群中存在一個(gè)在轉(zhuǎn)錄組水平與中期二細(xì)胞胚胎高度相似的細(xì)胞亞群（約10%）。他們定量分析了TPS細(xì)胞、杜鵬團(tuán)隊(duì)報(bào)道的TBLC中的全能干細(xì)胞亞群、二細(xì)胞樣細(xì)胞與二細(xì)胞胚胎的轉(zhuǎn)錄組相似度，發(fā)現(xiàn)TPS細(xì)胞中的全能干細(xì)胞亞群與二細(xì)胞胚胎的相似程度是最高的。ATAC-seq和全基因組甲基化分析也表明：TPS細(xì)胞具備了二細(xì)胞胚胎的表觀修飾特征。在發(fā)育潛能分析方面，他們通過在不同發(fā)育階段的單細(xì)胞嵌合實(shí)驗(yàn)證明了：單個(gè)TPS細(xì)胞具備了同時(shí)向胚內(nèi)和胚外發(fā)育的能力。為了嚴(yán)格證明TPS細(xì)胞在體內(nèi)的胚外發(fā)育潛能，他們對E17.5的嵌合胎盤進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明TPS來源的細(xì)胞可以分化形成多種胚外滋養(yǎng)層細(xì)胞類型。并且，他們發(fā)現(xiàn)tdTomato標(biāo)記的TPS細(xì)胞與有GFP標(biāo)記的受體胚胎形成的嵌合胎盤中，存在大量的tdTomato單陽性嵌合細(xì)胞，高表達(dá)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子標(biāo)記，排除了由細(xì)胞融合導(dǎo)致的假陽性可能。這些結(jié)果表明了TPS細(xì)胞具備了與二細(xì)胞胚胎相似的分子特征和發(fā)育潛能。

自組裝形成類囊胚結(jié)構(gòu)的能力是評估細(xì)胞全能性最為關(guān)鍵的功能性標(biāo)準(zhǔn)之一。研究者證明了通過調(diào)控早期胚胎發(fā)育的信號(hào)通路，可誘導(dǎo)TPS細(xì)胞高效形成類囊胚結(jié)構(gòu)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析表明，TPS誘導(dǎo)的類囊胚結(jié)構(gòu)中存在與小鼠E4.5囊胚中類似的上胚層、滋養(yǎng)外胚層、原始內(nèi)胚層細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)錄組水平上高度相似。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的定量分析，研究者進(jìn)一步比較了TPS-類囊胚結(jié)構(gòu)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞、小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞/多能干細(xì)胞組合誘導(dǎo)類囊胚中的滋養(yǎng)層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TPS-類囊胚結(jié)構(gòu)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞更類似于著床前囊胚中的小鼠滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。并且，不同于EPS細(xì)胞誘導(dǎo)的類囊胚結(jié)構(gòu)，TPS-類囊胚結(jié)構(gòu)中并不存在大量的中間態(tài)細(xì)胞及中胚層樣細(xì)胞。將TPS來源的類囊胚結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)后，可以誘導(dǎo)蛻膜化反應(yīng)，但是仍無法像正常囊胚那樣發(fā)育成個(gè)體，提示誘導(dǎo)類囊胚的方案仍需優(yōu)化。

最后，研究者分析了CPEC組合在TPS細(xì)胞中誘導(dǎo)和調(diào)控全能性的分子機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)抑制HDAC1/2和Dot1L的活性、以及特異激活RARγ通路，對TPS細(xì)胞的誘導(dǎo)和維持具有重要作用。有趣的是，當(dāng)用CPEC組合的小分子聯(lián)合處理小鼠二細(xì)胞胚胎時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)這些小分子處理能在一定程度上幫助維持小鼠胚胎中的全能性分子標(biāo)記的表達(dá)。這些結(jié)果表明HDAC1/2、Dot1L、RARγ通路的協(xié)同調(diào)控對于小鼠全能性調(diào)控的重要作用。

綜上所述，該研究利用化學(xué)調(diào)控的方法從小鼠二細(xì)胞胚胎中建立了新型的全能性干細(xì)胞，該細(xì)胞具有與二細(xì)胞胚胎相似的分子特征及雙向發(fā)育潛能，能夠形成與體內(nèi)著床前囊胚更相似的類囊胚結(jié)構(gòu)。這一工作不僅為體外研究全能性提供了更為合適和可靠的模型，而且朝著在不同哺乳動(dòng)物物種中利用全能性胚胎捕捉、維持全能性干細(xì)胞的目標(biāo)邁出了重要的一步。

鄧宏魁、李程、徐君是論文的共同通訊作者。北京大學(xué)徐亞星、趙晶薷、任奕璇、王旭陽和呂鈺麟為第一作者。本工作獲得了北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金等支持。

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來源：北京大學(xué)