神經(jīng)細(xì)胞的靜息膜電位（Resting Membrane Potential, RMP）影響著神經(jīng)細(xì)胞的可興奮性，對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞正常的生理功能至關(guān)重要。鈉漏通道NALCN（Sodium Leak Channel, Nonselective）介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的鈉漏電流，能使靜息膜電位更加去極化，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的可興奮性^1-4。NALCN在哺乳動(dòng)物中高度保守，與電壓門(mén)控鈣離子通道（CaV）和電壓門(mén)控鈉離子通道（NaV）同源性較高。NALCN參與了諸多與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的重要的生物學(xué)過(guò)程，包括呼吸節(jié)律的調(diào)節(jié)¹、痛覺(jué)感知⁵、生物鐘的調(diào)節(jié)⁶和快速動(dòng)眼睡眠⁷等。在人群中，NALCN的單點(diǎn)突變就會(huì)引起多種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育遺傳疾病，包括精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩和具有特征面相的小兒肌張力低下癥（IHPRF）^8,9，以及四肢和面部先天性攣縮、肌張力低下和發(fā)育遲緩癥（CLIFAHDD）¹⁰等。盡管NALCN通道有著如此重要的功能，但其工作機(jī)制仍不清楚。有報(bào)道顯示在HEK293細(xì)胞和爪蟾卵母細(xì)胞等異源體系中，只有共同表達(dá)NALCN，F(xiàn)AM155，UNC79和UNC80四個(gè)亞基，才能測(cè)量到明顯并且典型的鈉漏電流⁴。其中，NALCN是孔道形成亞基；FAM155是跨膜胞外調(diào)控亞基¹¹，協(xié)助NALCN上膜；而UNC79和UNC80是分子量巨大（300 kDa和370 kDa），且不與任何已知蛋白具有序列同源性的胞質(zhì)調(diào)控亞基³。

2022年5月12日，北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國(guó)家生物醫(yī)學(xué)成像中心陳雷研究組在Nature Communications 雜志上報(bào)道NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及UNC79-UNC80調(diào)節(jié)NALCN-FAM155A的機(jī)制。

陳雷研究組在2020年曾報(bào)道過(guò)NALCN-FAM155A亞復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)¹²，闡明了NALCN的鈉離子選擇性、胞外鈣離子阻塞和電壓調(diào)節(jié)特性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了在NALCN通道中獨(dú)有的位于II-III linker上的CIH螺旋結(jié)合在CTD上。但是UNC79和UNC80的結(jié)構(gòu)以及它們是如何激活NALCN的并不清楚。本項(xiàng)研究主要使用結(jié)構(gòu)生物學(xué)及電生理的手段，來(lái)探究UNC79和UNC80是如何激活NALCN的。先前的研究表明，UNC79和UNC80容易與NALCN-FAM155A亞復(fù)合體發(fā)生解離，因此，作者在NALCN的C末端融合了GFP，UNC80的N末端融合了與GFP高親和力結(jié)合的納米抗體以穩(wěn)定UNC79/80與NALCN間的相互作用。經(jīng)過(guò)同源蛋白篩選等步驟，作者們確定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A, UNC79和UNC80亞基組成的復(fù)合體為研究對(duì)象，并在克服了樣品制備、數(shù)據(jù)處理等困難后，通過(guò)單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了整體分辨率為3.2 ?的四元復(fù)合物的電子密度，并搭建了準(zhǔn)確的原子模型。結(jié)構(gòu)顯示UNC79和UNC80均由富含螺旋的結(jié)構(gòu)組成，這些螺旋進(jìn)一步的組裝成HEAT重復(fù)或ARM重復(fù)等超螺旋結(jié)構(gòu)。UNC79的N端與UNC80的C端、UNC79與UNC80的中間鉸鏈區(qū)以及UNC79的C端與UNC80的N端均存在著緊密的相互作用，形成鉗子狀的復(fù)合體，整體形狀類(lèi)似于無(wú)窮號(hào)“∞”（圖1）。除了HEAT重復(fù)和ARM重復(fù)外，UNC80含有一個(gè)類(lèi)泛素結(jié)構(gòu)域，并且UNC79和UNC80的還各含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。NALCN-FAM155A亞復(fù)合體位于UNC79和UNC80的中間鉸鏈區(qū)的上方，并且NALCN的跨膜區(qū)以及胞質(zhì)C端結(jié)構(gòu)域（CTD）并不直接與UNC79和UNC80發(fā)生相互作用。NALCN主要是通過(guò)胞內(nèi)loop區(qū)與UNC79-UNC80發(fā)生相互作用的：NALCN胞質(zhì)側(cè)的I-II linker中的一段β-發(fā)卡結(jié)構(gòu)（UNIM-A）與UNC79發(fā)生相互作用，II-III linker中的一段loop-螺旋結(jié)構(gòu)（UNIM-B）以及一段L型螺旋結(jié)構(gòu)（UNIM-C）與UNC80發(fā)生相互作用（圖1）。作者將NALCN與UNC79/80發(fā)生相互作用的基序命名為UNC Interacting Motif (UNIM)。

圖1：NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

隨后作者基于該結(jié)構(gòu)研究了UNC79和UNC80是如何調(diào)控NALCN活性的，發(fā)現(xiàn)UNC79, UNC80和FAM155A三個(gè)附屬亞基對(duì)于NALCN能夠正確的轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上是必不可少的。當(dāng)突變UNIM-A或UNIM-B以破壞UNIM-A或UNIM-B與UNC79/80的相互作用后，能夠正確轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上的NALCN變得很少，鈉漏電流也變得很小，表明UNIM-A和UNIM-B與UNC79/80之間的互作對(duì)于NALCN能夠正確轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上是必不可少的。這有可能是因?yàn)檫@些互作使UNC79/80遮擋了NALCN胞質(zhì)側(cè)loop上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，從而促進(jìn)NALCN上膜（圖2）。

圖2：UNC79-UNC80激活NALCN的機(jī)制的示意圖

與UNIM-A和UNIM-B不同的是，當(dāng)突變UNIM-C以破壞UNIM-C與UNC79/80的相互作用后，NALCN的上膜和鈉漏電流的大小均不受影響，但NALCN更難以被電壓激活，電導(dǎo)-電壓曲線（G-V curve）發(fā)生明顯右移。作者們發(fā)現(xiàn)UNIM-C與UNC80的互作會(huì)牽引II-III linker中原本結(jié)合在NALCN的CTD上的一段螺旋（CTD Interacting Helix, CIH）與CTD發(fā)生解離，從而解除CIH的自抑制作用，激活NALCN（圖2）。

該項(xiàng)研究在2021年12月21日即公布在預(yù)印本BioRxiv上（https://doi.org/10.1101/2021.12.20.473568）。在2021年12月美國(guó)基因泰克公司的Jian Payandeh研究組和2022年4月西湖大學(xué)的閆湞研究組分別在Nature¹³和Cell Discovery¹⁴雜志上也報(bào)道了人源的NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80復(fù)合體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。與這些研究相比，本研究觀察到的結(jié)構(gòu)整體相似，并且通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)闡明了UNC79-UNC80是如何通過(guò)促進(jìn)NALCN上膜以及解除CIH自抑制作用來(lái)激活NALCN的，為深入理解NALCN復(fù)合體的工作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本項(xiàng)研究第一作者為陳雷課題組博士后康云路，陳雷為第二作者兼通訊作者。本工作獲得科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心等經(jīng)費(fèi)支持。康云路獲得了北京大學(xué)博雅博士后獎(jiǎng)學(xué)金的支持。該工作的冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)上完成，得到了李雪梅、郭振璽、秦昌東、裴霞和王國(guó)鵬等人的幫助。該項(xiàng)目的數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)CLS計(jì)算平臺(tái)及未名超算平臺(tái)的硬件和技術(shù)支持。賓夕法尼亞大學(xué)Dejian Ren教授提供了大鼠和人源NALCN，小鼠UNC79和UNC80的cDNA。

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來(lái)源：北京大學(xué)