核糖體催化的蛋白質(zhì)生物合成是細(xì)胞中最精密、最關(guān)鍵的生命活動(dòng)之一。在肽鏈延伸過(guò)程中，柔性的尚未折疊的新生肽鏈有錯(cuò)誤折疊和引發(fā)蛋白質(zhì)聚集的風(fēng)險(xiǎn)，折疊不正常的新生蛋白質(zhì)可能通過(guò)細(xì)胞毒性等機(jī)制破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境^[1]。除此之外，新生肽鏈的質(zhì)量控制還和衰老及特定的病理?xiàng)l件密切相關(guān)。例如，近期的一項(xiàng)工作以秀麗隱桿線蟲和釀酒酵母為模型，研究了衰老和蛋白質(zhì)合成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在衰老細(xì)胞中核糖體翻譯延伸停滯機(jī)率的增加，尤其是編碼堿性氨基酸簇（K/R，polybasic stretches）的mRNA區(qū)域，誘發(fā)了核糖體翻譯質(zhì)量控制體系的超載和新生多肽的聚集，從而損害了細(xì)胞的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)繼而造成類型各異的細(xì)胞功能衰退^[2]。無(wú)論是真核還是原核細(xì)胞，都具有一系列的共翻譯調(diào)控系統(tǒng)，在肽鏈延伸的同時(shí)對(duì)新生肽鏈進(jìn)行修飾、加工，幫助其實(shí)現(xiàn)膜定位及輔助其折疊。RAC（ribosome-associated complex）和NAC（nascent chain-associated complex）是真核生物的兩種共翻譯折疊系統(tǒng)。研究表明釀酒酵母RAC對(duì)新生肽鏈中的poly-lysine序列的合成具有調(diào)控作用，表明RAC在折疊功能之外，可能直接參與核糖體上蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控。

RAC是由Hsp40和Hsp70組成的穩(wěn)定異源二聚體，在真核生物中高度保守，其在酵母中對(duì)應(yīng)蛋白為Zuo1和Ssz1。Zuo1的J-domain（JD）結(jié)構(gòu)域能夠特異招募酵母的另一個(gè)Hsp70蛋白質(zhì)因子Ssb1/2進(jìn)入到處于新生肽鏈合成過(guò)程中的核糖體復(fù)合物（RNC，ribosome-nascent chain complex），并特異激活Ssb的ATPase活性。ATP水解之后的Ssb-ADP與新生肽鏈穩(wěn)定結(jié)合直到其完成正確的折疊。遺傳數(shù)據(jù)表明，Zuo1、Ssz1、Ssb三者對(duì)于新生肽鏈的正確折疊缺一不可。RAC系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制一直是翻譯調(diào)控領(lǐng)域的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容，迄今為止，該系統(tǒng)的具體分子機(jī)制的諸多細(xì)節(jié)尚不清楚，例如一個(gè)Hsp40如何與兩個(gè)Hsp70配合、Hsp70Ssz1的分子功能、Hsp40Zuo1如何特異招募Hsp70Ssb，新生肽鏈如何與三個(gè)蛋白質(zhì)組分發(fā)生相互作用等等。

2022年6月14日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧課題組于Nature Communications在線發(fā)表了題為“Structural remodeling of ribosome associated Hsp40-Hsp70 chaperones during co-translational folding”的研究論文。該研究以釀酒酵母為模型，利用冷凍電鏡技術(shù)解析了細(xì)胞內(nèi)源的RAC-80S復(fù)合物、不同狀態(tài)的RAC-RNC復(fù)合物的十余個(gè)高分辨結(jié)構(gòu)，揭示了RAC-Hsp70系統(tǒng)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，提出了RAC-Ssb的工作機(jī)制模型。

首先，結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，與課題組2014年發(fā)表的首個(gè)RAC-核糖體低分辨結(jié)構(gòu)^[3]一致，Zuo1的N端和C端結(jié)構(gòu)域在空間上分別結(jié)合核糖體的大亞基和小亞基。不同的是，在分辨大幅提高的情況下RAC與核糖體的相互作用細(xì)節(jié)能夠被清楚地呈現(xiàn)。RAC結(jié)合在核糖體小亞基40S解碼中心的rRNA helix 44末端的Zuo14HB結(jié)構(gòu)域使helix 44發(fā)生了明顯的構(gòu)象變化，揭示了RAC調(diào)控核糖體上的功能中心的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（圖1 a）。RAC剩余的部分（Zuo1 NTD）結(jié)合在核糖體大亞基60S的肽鏈通道出口（PTE，peptide exit tunnel），直接和新生肽鏈發(fā)生相互作用。

圖1. 不同狀態(tài)的S. cerevisiaeRAC-核糖體復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

通過(guò)針對(duì)Zuo1-NTD的局部分類與計(jì)算，該研究首次解析了近全長(zhǎng)的RAC結(jié)構(gòu)（圖1 b-c）。通過(guò)解析和對(duì)比無(wú)新生肽鏈的RAC-80S復(fù)合物、帶有新生肽鏈的RAC-RNC和RAC-RNC(+Ssb1-ATP)復(fù)合物的十余個(gè)不同狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，該研究發(fā)現(xiàn)：（1）在核糖體不進(jìn)行翻譯或新生肽鏈尚未暴露時(shí)，RAC中僅Zuo1與60S相互作用。其中Ssz1遠(yuǎn)離PTE不與核糖體直接接觸，通過(guò)對(duì)Zuo1 JD形成空間位阻使其不能招募Ssb，處于自抑制狀態(tài)（圖1 d）；（2）隨著翻譯延伸的進(jìn)行，新生肽鏈從PTE暴露出來(lái)，它首先與Zuo1結(jié)合在PTE附近的一小段螺旋結(jié)構(gòu)的疏水表面相互作用，因此Zuo1是RAC-Ssb系統(tǒng)中第一個(gè)與新生肽鏈相互作用的組分；（3）新生肽鏈的存在還引發(fā)了RAC從自抑制狀態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，不同程度地削弱了Ssz1對(duì)Zuo1 JD空間阻擋（圖1 e-f）。在其中一個(gè)較為穩(wěn)定的構(gòu)象中，Ssz1進(jìn)行了大幅度的空間翻轉(zhuǎn)，NBD（nucleotide binding domain）與核糖體相互作用，導(dǎo)致Ssz1罩在PTE正上方，對(duì)該空間形成保護(hù)之勢(shì)（圖1 e）；在Zuo1-Ssz1-PET包圍的空間內(nèi)有一段對(duì)應(yīng)3-4個(gè)氨基酸的電子密度，可能是新生肽鏈，因此Ssz1可能是RAC-Ssb中第二個(gè)與新生肽鏈發(fā)生相互作用的組分；（4）而在RAC-RNC中加入Ssb1-ATP后，解析的所有結(jié)構(gòu)中均沒有觀察到穩(wěn)定的Ssz1和Ssb1密度（圖1 g）；傳統(tǒng)的Hsp40和其Hsp70搭檔的相互作用是瞬時(shí)的，因此推測(cè)此時(shí)的Ssz1和Ssb1都處于高度動(dòng)態(tài)的構(gòu)象狀態(tài)。

基于這些新的結(jié)構(gòu)觀察以及已有文獻(xiàn)報(bào)道，該研究提出了RAC-Ssb系統(tǒng)的工作機(jī)制模式圖（圖2）。在這一過(guò)程中，不斷延伸的新生肽鏈通過(guò)與系統(tǒng)中的不同蛋白質(zhì)因子發(fā)生相互作用，從而引起級(jí)聯(lián)的構(gòu)象重組過(guò)程，使得RAC-Ssb系統(tǒng)能夠高效地捕捉新生肽鏈上的底物序列，從而及時(shí)對(duì)這些序列進(jìn)行保護(hù)。綜上，該研究揭示了新生肽鏈引發(fā)的RAC構(gòu)象轉(zhuǎn)變的分子基礎(chǔ)，闡述了RAC-Ssb系統(tǒng)中3個(gè)組成因子在共翻譯折疊過(guò)程中分工合作的分子機(jī)理（圖2），對(duì)進(jìn)一步理解共翻譯調(diào)控和蛋白質(zhì)折疊機(jī)理具有重要意義。

圖2. RAC-Ssb共翻譯折疊系統(tǒng)的分子機(jī)制

高寧教授為該論文的通訊作者，課題組2016級(jí)博士生陳燕（已畢業(yè)）為本文的第一作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、啟東-SLS創(chuàng)新基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持。北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、電鏡實(shí)驗(yàn)室、高性能計(jì)算平臺(tái)、生命科學(xué)學(xué)院儀器中心及鳳凰工程等多個(gè)儀器平臺(tái)對(duì)本項(xiàng)目提供了重要的技術(shù)支撐。

1. Rosenzweig, R., et al., The Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol, 2019. 20(11): p. 665-680.

2. Stein, K.C., et al., Ageing exacerbates ribosome pausing to disrupt cotranslational proteostasis. Nature, 2022. 601(7894): p. 637-642.

3. Zhang, Y., et al., Structural basis for interaction of a cotranslational chaperone with the eukaryotic ribosome. Nat Struct Mol Biol, 2014. 21(12): p. 1042-6.

來(lái)源：北京大學(xué)