隨著三代測(cè)序技術(shù)（TGS，也即單分子測(cè)序技術(shù)）的發(fā)展，基于大量細(xì)胞的三代基因組測(cè)序數(shù)據(jù)被廣泛應(yīng)用于各種復(fù)雜大型基因組的組裝，由于其讀長(zhǎng)相比于二代測(cè)序（NGS）技術(shù)有數(shù)百倍的增加，因此基因組中重復(fù)序列區(qū)域以及染色體重排等復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異區(qū)域都能被更好地組裝出來(lái)。

對(duì)于人類基因組的組裝研究，端粒到端粒（T2T）聯(lián)盟在2022年3月，使用純合二倍體細(xì)胞系CHM13率先發(fā)布了首個(gè)完整的端粒到端粒的人類基因組參考序列CHM13v1.1。2022年3月，人類泛基因組聯(lián)盟（HPRC）在預(yù)印本平臺(tái)bioRxiv上發(fā)布了首個(gè)高質(zhì)量人類雜合二倍體細(xì)胞系HG002的單倍型組裝結(jié)果。

目前，高質(zhì)量的基因組組裝通常依賴于大量細(xì)胞混合樣本的三代測(cè)序數(shù)據(jù)，需要大量的基因組DNA（通常需要從數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中提取幾十微克基因組DNA），然而在基因組組裝的實(shí)際應(yīng)用中常常要面對(duì)兩個(gè)困難：

1、細(xì)胞群體中存在遺傳異質(zhì)性?；诖罅考?xì)胞三代測(cè)序數(shù)據(jù)的基因組組裝需要確保測(cè)序的樣本中每個(gè)細(xì)胞的遺傳背景高度一致，否則組裝結(jié)果將很難區(qū)分同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的不同單倍型基因組之間的差異和不同細(xì)胞亞群之間的基因組差異。只有降低或者消除細(xì)胞間的遺傳異質(zhì)性才能確保單倍型組裝的準(zhǔn)確性。但是，在人體正常組織樣本中也常常廣泛存在體細(xì)胞拷貝數(shù)變異（CNA）。與此同時(shí)，正常的人類細(xì)胞也會(huì)不斷積累突變，同一塊人體組織常常是由很多包含不同突變的細(xì)胞克隆組成。在癌癥研究中，同一個(gè)腫瘤樣本中不同癌細(xì)胞亞克隆之間的基因組異質(zhì)性就更為明顯。

2、細(xì)胞數(shù)量稀少。在很多情況下，很難獲取上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以提取大量（幾微克）基因組DNA。例如，在早期胚胎發(fā)育研究、司法檢驗(yàn)、特別是在癌癥基因組研究中（如循環(huán)腫瘤細(xì)胞、腫瘤活檢樣本、腦脊液中的腫瘤細(xì)胞、以及腹水中的腫瘤細(xì)胞等），能夠獲取的細(xì)胞數(shù)量常常很稀少，而且這些細(xì)胞很難在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增；即使偶爾可以培養(yǎng)擴(kuò)增，也不能保證在體外培養(yǎng)擴(kuò)增過(guò)程中其基因組不會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生新的遺傳變異。

基于二代測(cè)序（NGS）平臺(tái)的單細(xì)胞基因測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物等簡(jiǎn)單小型基因組的組裝。許多種類的細(xì)菌無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，單細(xì)胞基因組測(cè)序可以與宏基因組學(xué)方法結(jié)合起來(lái)完成微生物的基因組組裝。由于人類基因組結(jié)構(gòu)、大小、以及復(fù)雜程度遠(yuǎn)超細(xì)菌等微生物，單純使用基于二代測(cè)序平臺(tái)的大量細(xì)胞基因組測(cè)序數(shù)據(jù)也無(wú)法組裝出高質(zhì)量的人類基因組參考序列（NG50很難達(dá)到Mb（百萬(wàn)堿基對(duì)）級(jí)別），那么使用少量DNA甚至單細(xì)胞基因組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝人類基因組則更具挑戰(zhàn)性，它不僅需要基于三代測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞基因組長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)的支持，還需要合適的組裝軟件以及良好的生物信息學(xué)分析策略。

2022年7月12日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組在Nucleic Acids Research發(fā)表了題為De novo assembly of human genome at single-cell levels的研究論文。該研究使用優(yōu)化的SMOOTH-seq單細(xì)胞基因組三代測(cè)序技術(shù)，基于Pacific Biosciences（PacBio）HiFi和Oxford Nanopore Technologies（ONT）兩種三代測(cè)序平臺(tái)首次在單細(xì)胞水平上完成了Mb級(jí)連續(xù)性的人類基因組組裝，并使用多種評(píng)價(jià)指標(biāo)，充分探索了不同測(cè)序策略和組裝工具對(duì)基因組組裝結(jié)果的影響。

1、全面優(yōu)化了SMOOTH-seq單細(xì)胞基因組三代測(cè)序技術(shù)，使其同時(shí)適用于PacBio和ONT兩種主流單分子測(cè)序平臺(tái)。此前的SMOOTH-seq技術(shù)只適用于PacBio單分子測(cè)序平臺(tái)，使用場(chǎng)景有較大的局限性。優(yōu)化后的SMOOTH-seq技術(shù)既可以用于PacBio單分子測(cè)序平臺(tái)，也可以用于ONT單分子測(cè)序平臺(tái)，使用場(chǎng)景更加靈活，可以兼顧測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和測(cè)序成本。

2、使用hifiasm，Hicanu，wtdbg2等主流組裝工具和95個(gè)單細(xì)胞的三代基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（Pacbio HiFi平臺(tái)），對(duì)人類慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML）細(xì)胞系K562進(jìn)行了高質(zhì)量基因組組裝。組裝出的主要疊連群（primary contig）的NG50（可覆蓋50%的已知基因組區(qū)域的最短疊連群的長(zhǎng)度）可達(dá)2.11Mb，也就是說(shuō)在這個(gè)組裝出的參考序列中，人類基因組中一半（15億堿基對(duì)）以上的區(qū)域都被至少2.11Mb以上的疊連群覆蓋了。最長(zhǎng)疊連群可達(dá)14.12Mb，完整的通用單拷貝同源基因基準(zhǔn)（Complete BUSCOs）比例接近95%，且大部分組織相容性復(fù)合體（MHC）位點(diǎn)（基因組上的一個(gè)有代表性的復(fù)雜區(qū)域，全長(zhǎng)約6Mb）被成功組裝出來(lái)（如圖1所示）。

圖1. 95個(gè)K562細(xì)胞的基因組組裝結(jié)果（Pacbio HiFi）

3、使用hifiasm，Hicanu，wtdbg2等主流組裝工具和人類正常二倍體細(xì)胞系HG002的157個(gè)單細(xì)胞的基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)（Pacbio HiFi平臺(tái)）對(duì)人類基因組進(jìn)行了高質(zhì)量組裝。組裝出的主要疊連群（primary contig）的NG50可達(dá)0.65Mb，最長(zhǎng)的疊連群可達(dá)6.82Mb，完整的通用單拷貝同源基因基準(zhǔn)（Complete BUSCOs）比例接近91%。在使用此數(shù)據(jù)進(jìn)行HG002的單倍型組裝的過(guò)程中該研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)指數(shù)擴(kuò)增的基因組數(shù)據(jù)的k-mer分布會(huì)發(fā)生偏移，因此使用有雙親二代測(cè)序數(shù)據(jù)作為輔助的Trio-binning模式進(jìn)行基因組單倍型組裝結(jié)果更為準(zhǔn)確。因此該研究分別使用Trio hifiasm和Trio Hicanu兩種組織工具進(jìn)行單倍型組裝，得到的親本疊連群的NG50可達(dá)0.3Mb左右，完整的通用單拷貝同源基因基準(zhǔn)（Complete BUSCOs）比例均超過(guò)84%。通過(guò)比較HG002親本六種經(jīng)典人類白細(xì)胞抗原（HLA）位點(diǎn)的組裝分型結(jié)果，Trio Hicanu能夠正確組裝出HLA區(qū)域的兩個(gè)親本的大部分基因位點(diǎn)（如圖2所示）。

圖2. 157個(gè)HG002細(xì)胞的基因組組裝結(jié)果（Pacbio HiFi）

4、使用Flye，Necat，wtdbg2等主流組裝工具和人類正常二倍體細(xì)胞系HG002的192個(gè)單細(xì)胞的三代基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（ONT平臺(tái)，低測(cè)序深度）對(duì)人類基因組進(jìn)行高質(zhì)量組裝。研究發(fā)現(xiàn)，不同的組裝工具對(duì)最終組裝結(jié)果有很大影響，F(xiàn)lye展現(xiàn)出更為適合單細(xì)胞ONT三代測(cè)序數(shù)據(jù)的特性，組裝出的疊連群的NG50可達(dá)1.38Mb，最長(zhǎng)疊連群可達(dá)11.42Mb，完整的通用單拷貝同源基因基準(zhǔn)（Complete BUSCOs）比例超過(guò)93%，多項(xiàng)指標(biāo)都遠(yuǎn)超另外兩個(gè)組裝工具。同時(shí)組裝結(jié)果能夠補(bǔ)齊39個(gè)hg38版本的人類參考基因組中未組裝出的缺口（gap）區(qū)域，其中14個(gè)區(qū)域在hg38中注釋的長(zhǎng)度超過(guò)50Kb（如圖3所示）。

圖3. 192個(gè)HG002細(xì)胞以及30個(gè)HG002細(xì)胞的基因組組裝結(jié)果（ONT）

5、使用Flye，wtdbg2等組裝工具和人類正常二倍體細(xì)胞系HG002的30個(gè)單細(xì)胞的三代基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（ONT平臺(tái)，高測(cè)序深度）對(duì)人類基因組進(jìn)行高質(zhì)量組裝。為了探究?jī)H使用極少量單細(xì)胞的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行人類基因組組裝的極限情況，該研究分別使用1個(gè)、10個(gè)、20個(gè)和30個(gè)單細(xì)胞嘗試進(jìn)行人類基因組組裝，發(fā)現(xiàn)僅需要高測(cè)序深度的30個(gè)單細(xì)胞的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（平均基因組覆蓋度~41.7%）就能完成疊連群 NG50高達(dá)1.34Mb連續(xù)性的組裝。同時(shí)組裝結(jié)果能夠補(bǔ)齊38個(gè)hg38版本的人類參考基因組未組裝出的gap區(qū)域，其中15個(gè)區(qū)域在hg38注釋的長(zhǎng)度超過(guò)50Kb（如圖4所示）。

圖4. 30個(gè)基因組高覆蓋度HG002細(xì)胞的基因組組裝結(jié)果（ONT）

6、通過(guò)對(duì)K562細(xì)胞系基因組的從頭組裝，該研究相比于使用原始單細(xì)胞基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)能更精準(zhǔn)地鑒定出更多的基因組插入事件和復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異事件。對(duì)于K562這樣的白血病細(xì)胞系，基因組從頭組裝之后是否能更好地鑒定出基因組結(jié)構(gòu)變異（SV）事件是癌癥研究中的重要問(wèn)題。該研究分別使用hifiasm和Hicanu組裝出的主要（primary）疊連群和替代（alternate） 疊連群來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異鑒定。發(fā)現(xiàn)組裝后的疊連群比起原始單細(xì)胞數(shù)據(jù)直接比對(duì)能更準(zhǔn)確地鑒定出基因組插入事件，召回率達(dá)到70%以上，精確度達(dá)到90%以上。同時(shí)，K562中的三對(duì)經(jīng)典融合基因：CDC25A-GRID1、BCR-ABL1和NUP214-XKR3都能被精準(zhǔn)地鑒定出來(lái)，而CDC25A-GRID1融合在原始單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)直接比對(duì)到參考基因組時(shí)是無(wú)法被發(fā)現(xiàn)的 (如圖5所示) 。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因組從頭組裝后找到的結(jié)構(gòu)變異事件的準(zhǔn)確性，該研究挑選了20個(gè)（14個(gè)插入事件，6個(gè)缺失事件）在組裝后的疊連群中被鑒定到、但是在單細(xì)胞基因組原始測(cè)序數(shù)據(jù)直接比對(duì)到參考基因組時(shí)沒(méi)有被鑒定出來(lái)的結(jié)構(gòu)變異事件進(jìn)行了PCR驗(yàn)證，準(zhǔn)確率高達(dá)80%，證明了組裝后的疊連群對(duì)結(jié)構(gòu)變異事件的鑒定是精準(zhǔn)可靠的（如圖6所示）。

圖5. 組裝后疊連群（contig）中結(jié)構(gòu)變異事件檢測(cè)的準(zhǔn)確性

?

圖6. PCR驗(yàn)證基因組結(jié)構(gòu)變異事件的結(jié)果

綜上，為了解決基因組從頭組裝在實(shí)際應(yīng)用中遇到的細(xì)胞遺傳異質(zhì)性和細(xì)胞稀缺性的問(wèn)題，該研究使用優(yōu)化的SMOOTH-seq技術(shù)在兩種不同的主流三代測(cè)序平臺(tái)上，采用不同的測(cè)序策略（高通量、低深度測(cè)序策略（multi-cells with low sequencing depth）和低通量、高深度測(cè)序策略（few-cells with high sequencing depth）），使用多種不同組裝軟件（hifiasm，Hicanu，wtdbg2, Flye，Necat等）、多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)、以及不同組裝策略，探討了利用單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)從頭組裝人類基因組的可行性，并確定了影響組裝結(jié)果的主要因素，將基因組組裝的分辨率提高到單細(xì)胞水平（少至30個(gè)單細(xì)胞）。未來(lái)隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)和基因組組裝策略的進(jìn)一步發(fā)展，最終必將實(shí)現(xiàn)只用一個(gè)單細(xì)胞的測(cè)序數(shù)據(jù)就能組裝出Mb級(jí)連續(xù)性的人類參考基因組的夢(mèng)想。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生謝昊伶以及北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士生李文為該論文的并列第一作者。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授為該論文的通訊作者。該研究項(xiàng)目得到了北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國(guó)家自然科學(xué)基金委、北京市科技委和北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的支持。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac586

湯富酬，博士，北京大學(xué)BIOPIC/ICG研究員，國(guó)家“優(yōu)青”(2013)、“杰青”(2016）。1998年本科畢業(yè)于北京大學(xué)，2003年在北大獲得細(xì)胞生物學(xué)博士學(xué)位，2004-2010年間在英國(guó)劍橋大學(xué)Gurdon研究所從事博士后研究， 2010年回到北京大學(xué)組建實(shí)驗(yàn)室，主要從事人類早期胚胎發(fā)育的單細(xì)胞功能基因組學(xué)研究。在國(guó)際上率先系統(tǒng)發(fā)展了單細(xì)胞功能基因組學(xué)研究體系，并利用一系列技術(shù)體系對(duì)人類早期胚胎發(fā)育進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究，揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化過(guò)程的異質(zhì)性以及其他表觀遺傳學(xué)關(guān)鍵特征，發(fā)現(xiàn)了人類早期胚胎中基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的重要表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)理，為人們提供了一個(gè)全面分析人類早期胚胎表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究框架，加深了對(duì)人類原始生殖細(xì)胞的發(fā)育以及表觀遺傳重編程過(guò)程的認(rèn)識(shí)。