Science｜纖毛基體的原位結(jié)構(gòu)揭示了鞭毛內(nèi)運輸復(fù)合物的逐步組裝機制
纖毛（cilia），又稱為鞭毛（flagella），是突起于真核細胞表面的一類重要細胞器，在細胞運動，胚胎發(fā)育，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用【1】。纖毛主要由基體（basal body）、軸絲（axoneme）、纖毛膜（ciliary membrane）和纖毛基質(zhì)組成，二聯(lián)管（microtubule doublets, MTDs）作為軸絲從基體中的三聯(lián)管（microtubule triplets, MTTs）中延伸出來，被纖毛膜所包被（圖1）【2】。在纖毛基體處，一個被稱為過渡區(qū)（transition zone，TZ）的特化區(qū)域可以調(diào)節(jié)膜結(jié)合和可溶纖毛蛋白的進入與離開【3】。在眾多門控功能中，TZ被認為是可以調(diào)節(jié)鞭毛內(nèi)運輸（intraflagellar transport，IFT）——由驅(qū)動蛋白和動力蛋白作為馬達介導(dǎo)鞭毛基體與頂端之間的雙向運輸【4】。IFT對于纖毛的組裝和穩(wěn)定至關(guān)重要，一系列IFT蛋白和馬達殘留在纖毛基體等待以進入纖毛【5】。然而，這些蛋白是如何組裝成為復(fù)雜的IFT復(fù)合物從而沿著纖毛軸絲運動是仍待解釋的問題。
圖1 纖毛的結(jié)構(gòu)（來自維基百科）
2022年7月29日，來自瑞士巴塞爾大學(xué)的Benjamin D. Engel課題組在Science上發(fā)表了名為In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains的文章，通過結(jié)合冷凍電鏡斷層掃描（cryo-ET）和超分辨結(jié)構(gòu)擴展光學(xué)顯微鏡（U-ExM）技術(shù)觀察綠藻的纖毛，揭示了原位的TZ結(jié)構(gòu)和IFT復(fù)合物在纖毛基體逐步組裝的機制。
圖2 綠藻纖毛原位TZ的cryo-ET結(jié)構(gòu)
通過cryo-ET技術(shù)，作者觀察到了不同類型的結(jié)構(gòu)附著在了MTD上（圖2A和圖2B），斷層子圖平均如圖2C～H所示。近端直徑約為180nm的TZ區(qū)域被表面的Y-link（圖2，綠色部分）和腔內(nèi)的星狀纖維（圖2，紫色部分）所占據(jù)。星狀纖維在橫截面中可見組裝為9點星（圖2E），同時組裝為6-螺旋重復(fù)的圓柱體，每一循環(huán)高度為49.2nm（圖2H），與MTD的A3原纖維相結(jié)合，縱向周期為8.1nm（圖2F）。Y-link將MTD與纖毛膜相連接并且?guī)椭T控轉(zhuǎn)運進入和離開纖毛，結(jié)構(gòu)中揭示了Y-link結(jié)合MTDA9、A10、B1～B4原纖維結(jié)合，縱向周期為8.3nm（圖2F），但是結(jié)構(gòu)中Y-link外部與纖毛膜結(jié)合密度可能由于高動態(tài)性沒有被解析出來。
而在遠端區(qū)域，有一個不同的螺旋密度包裹在MTD周圍（圖2G，深藍色），稱之為MTD鞘，由于其在近端缺乏而存在于遠端，作者因此做出假設(shè)這一結(jié)構(gòu)可能幫助調(diào)節(jié)軸絲剪切并在此過程中遺失。
圖3 結(jié)合TZ區(qū)域的IFT復(fù)合物的cryo-ET結(jié)構(gòu)
IFT蛋白定位于臨近纖毛基體，但是其結(jié)構(gòu)組裝方式多年來仍然未知。在解析到的cryo-ET結(jié)構(gòu)中，作者觀察到像纖維絲一樣的粒子，位于過渡纖維之間（圖3A），其一個末端與TZ相接觸，另外一個末端則伸向細胞質(zhì)（圖3B和圖3C）。根據(jù)斷層子圖平均作者得到了粒子復(fù)合物的完整結(jié)構(gòu)（圖3D），為IFT復(fù)合物。作者發(fā)現(xiàn)IFT復(fù)合物在成熟和組裝狀態(tài)呈現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)，在成熟狀態(tài)中（纖毛內(nèi)部），IFT為延伸的直鏈狀態(tài)，由IFT-B（黃色）、IFT-A（橙色）和動力蛋白-1b（紅色）組成，而其靠近TZ區(qū)域，則組裝復(fù)合物變得較為柔性，且彎曲率變大，同時可以看見IFT-A和動力蛋白-1b未被組裝上來（圖3A）。
圖4 IFT復(fù)合物在組裝狀態(tài)和成熟狀態(tài)的組成成分分布圖
為了更好地分析IFT組裝或成熟狀態(tài)與TZ區(qū)域之間的關(guān)系，作者通過利用原始的顆粒分子信息勾畫了每個IFT復(fù)合物在組裝狀態(tài)或成熟狀態(tài)的組成成分分布圖（圖4A和圖4C），累積曲線展示不同組分非常清晰的分布關(guān)系（圖4B），IFT-B從頭到尾一直存在，而隨著從遠端（頭部）到近端（尾部），動力蛋白-1b及隨后的IFT-A逐漸消失。將組裝狀態(tài)與成熟狀態(tài)做比較，可以看到成熟狀態(tài)中間部分的IFT-ABD亞基數(shù)目更多，而未成熟狀態(tài)近端（尾部）的IFT-B亞基延伸得則更長（圖4D）。
圖5. 通過U-ExM來檢測IFT復(fù)合物的組裝方式
驅(qū)動蛋白-2由于小分子量和動態(tài)性，難以通過cryo-ET進行定位及解析，因此作者轉(zhuǎn)向使用U-ExM來檢測驅(qū)動蛋白-2在IFT組裝狀態(tài)上的分布情況，通過熒光可以觀察到驅(qū)動蛋白-2（圖5A）、動力蛋白-1b（圖5B）、IFT-B（圖5C、圖5D、圖5F和圖5G）和IFT-A（圖5E）。其分布與cryo-ET的結(jié)果較為類似，IFT-B的長度比IFT-A和動力蛋白-1b長，而驅(qū)動蛋白-2長度最短，且更靠近IFT的遠端（頭部）（圖5H）。IFT的雙組分標(biāo)記熒光證實了IFT-A比驅(qū)動蛋白-2延伸得更長，而IFT-B比IFT-A延伸得更長（圖5I和圖5J）。同時也可以看到IFT在TZ中呈現(xiàn)出9次重復(fù)（圖5F和圖5G）。
綜上，作者通過結(jié)合cryo-ET和U-ExM提供了IFT復(fù)合物組裝的空間時序過程（圖5K），IFT-B首先形成骨架，然后從頭部到尾部招募IFT-A、動力蛋白-1b并最終結(jié)合在驅(qū)動蛋白-2上。但是仍有遺留的問題在本篇文章中沒有被解決，IFT進入纖毛是如何被調(diào)節(jié)的，比如組裝狀態(tài)的纖毛的頭部是如何被阻止進入纖毛的？作者給出的可能解釋是TZ處的調(diào)控因子可能調(diào)節(jié)驅(qū)動蛋白-2的載入、MTD鞘作為屏障阻止小的IFT復(fù)合物進入或者額外的IFT-B相關(guān)的分子作為制動器阻止進入。
science.org/doi/10.1126/science.abm6704
【1】M. V. Nachury, D. U. Mick, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 389–405 (2019).
【2】D. R. Mitchell, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, a028290 (2017).
【3】Q. Hu et al., Science 329, 436–439 (2010).
【4】G. Pigino, Curr. Biol. 31, R530–R536 (2021).
【5】J. V. K. Hibbard, N. Vazquez, R. Satija, J. B. Wallingford, Mol. Biol. Cell 32, 1171–1180 (2021).
來源：結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心
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