2022年11月9日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧教授課題組于Nature Communications在線發(fā)表了題為“Structural dynamics of AAA?+?ATPase Drg1 and mechanism of benzo-diazaborine inhibition”的研究論文。該研究利用冷凍電鏡技術(shù)解析了多種核苷酸狀態(tài)下的Drg1結(jié)構(gòu)，以及底物結(jié)合狀態(tài)下的六聚體結(jié)構(gòu)，基于高分辨結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)分析詳細(xì)的闡明了Drg1發(fā)揮功能的分子機(jī)制。同時，本研究還解析了藥物Benzo-diazaborine（B-Dia）結(jié)合狀態(tài)下Drg1六聚體的高分辨率結(jié)構(gòu)，揭示了該藥物的作用分子機(jī)制。

核糖體是蛋白質(zhì)翻譯的場所，是將遺傳信息由mRNA傳遞為蛋白質(zhì)氨基酸序列的加工廠。真核生物核糖體組裝是一個高度復(fù)雜、精密且又耗能的過程，涉及rRNA的轉(zhuǎn)錄、加工與成熟；核糖體蛋白的翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)；多種核糖體組裝因子的結(jié)合和解離等過程。核糖體最初的組裝發(fā)生在核仁中，然后核糖體前體被運(yùn)送到核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，并在細(xì)胞質(zhì)中完成最后的成熟。在真核生物細(xì)胞中，有超過200種核糖體組裝因子參與此過程，其中包括三種分別定位于核仁、核基質(zhì)以及細(xì)胞基質(zhì)中的AAA+ ATPases (ATPases associated with a variety of cellular activities)—Rix7，Real和Drg1。其中Drg1在酵母中為必須基因，其人源中的同源蛋白SPATA5與精子的發(fā)生密切相關(guān)。SPATA5的突變會導(dǎo)致癲癇、聽力障礙或智力障礙等疾病的發(fā)生。當(dāng)前體60S核糖體（pre-60S）從細(xì)胞核經(jīng)核孔復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中后，Drg1結(jié)合到pre-60S上，啟動了核糖體在胞質(zhì)中的成熟過程，并釋放了核糖體組裝因子Nog1，Rlp24，Tif6和Mrt4等核糖體組裝因子。有研究報道，Rlp24的C端結(jié)構(gòu)域通過與Drg1相互作用，增加其ATPase活性；并且Drg1釋放組裝因子這一過程可能需要輔助蛋白（Adaptor/co-factor）的參與。Drg1的生物學(xué)活性可以被硼雜環(huán)化合物diazaborine（Benzo-diazaborine）抑制，導(dǎo)致pre-60S在胞質(zhì)中的積累，而引起細(xì)胞功能紊亂。但是，迄今為止，Drg1完整的、高分率的結(jié)構(gòu)未知，其轉(zhuǎn)運(yùn)底物的詳細(xì)分子機(jī)制不明，抑制劑的結(jié)合位點和作用機(jī)理不清。

基于高分辨結(jié)構(gòu)，該研究解析了Drg1的高分辨結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)與其他經(jīng)典的II型AAA+ ATPase類似，由NTD，D1和D2形成三層結(jié)構(gòu)，并形成同源六聚體發(fā)揮功能。有趣的是，Drg1的NTD雖在序列與Cdc48/p97同源性較低，其三維結(jié)構(gòu)卻是高度相似的；這從結(jié)構(gòu)上也提示著，Drg1在發(fā)揮功能時可能也需要將底物蛋白徹底解折疊成多肽。在底物結(jié)合狀態(tài)下的Drg1六聚體結(jié)構(gòu)中，Drg1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Walker A、Walker B、Sensor I、Sensor II、arginine finger（AF）、pore loops I 和II (PL-I和PL-II)、ISS等都清晰可見。Drg1的D1和D2通過保守的Pore-loop（PL）芳香族氨基酸殘基圍繞著底物，并且呈螺旋階梯式上升，每個PL像是一個抓住底物的手，以“Hand-over-hand”的方式進(jìn)行底物的轉(zhuǎn)運(yùn)。Drg1的六個亞基（P：protomer）中，P1-5通過PLs與多肽底物發(fā)生相互作用，而P6遠(yuǎn)離底物，且D2的核苷酸結(jié)合口袋是空的?；趯Y(jié)構(gòu)的分析推測Drg1的作用機(jī)制如下：當(dāng)P6結(jié)合ATP后，會重新結(jié)合底物，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)镻1的狀態(tài)；同時，P5結(jié)合的ATP會水解成ADP，轉(zhuǎn)變?yōu)镻6的狀態(tài)，并遠(yuǎn)離底物，Drg1以此模式周而復(fù)始的進(jìn)行底物的去折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)構(gòu)顯示Drg1保守的ISS（Inter-subunit signaling）motif參與了相鄰亞基間的協(xié)同作用以及通過其構(gòu)像變化調(diào)控ATPase活性。結(jié)合ATP后，鄰近protomer的ISS會由螺旋構(gòu)象（Helical conformation）轉(zhuǎn)變?yōu)槿切蔚膌oop（Triangular loop），并伸向核苷酸結(jié)合口袋；同時，ISS的構(gòu)象變化和PLs與底物的結(jié)合和解離相偶聯(lián)。遺傳數(shù)據(jù)也表明ISS、D1-D2之間的linker和PLs的突變均會影響核糖體的組裝效率和細(xì)胞的生長。

圖1. 底物結(jié)合狀態(tài)的Drg1結(jié)構(gòu)

Diazaborine最初被發(fā)現(xiàn)為一種抗菌化合物，能阻礙脂肪酸和磷脂的生物合成，從而防止細(xì)菌增殖。Diazaborine能夠抑制Drg1的ATPase活性，從而導(dǎo)致穿梭蛋白在pre-60S上的積累，影響pre-60S的成熟。在解析的B-Dia結(jié)合的Drg1六聚體結(jié)構(gòu)中，可以清晰的看到12個ATP/B-dia結(jié)合在D1和D2的核苷酸結(jié)合口袋中。B-Dia與ATP分子中核糖的2’-OH形成共價鍵，抑制了ATP的水解，將Drg1鎖在一個較平、對稱的結(jié)構(gòu)，從而阻斷了D1和D2的構(gòu)象變化和功能的執(zhí)行。

圖2. B-Dia結(jié)合狀態(tài)下的Drg1冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

綜上所述，該研究工作解析了不同核苷酸狀態(tài)下的Drg1六聚體結(jié)構(gòu)，詳細(xì)的闡明了不同核苷酸狀態(tài)下的Drg1六聚體構(gòu)象變化。解析了底物處理過程中的Drg1六聚體結(jié)構(gòu)，闡述了Drg1底物轉(zhuǎn)運(yùn)的詳細(xì)分子機(jī)制。對深入理解Drg1在核糖體大亞基的成熟過程中所發(fā)揮的作用具有重要意義。該文章的結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)表明Drg1很可能通過發(fā)揮蛋白質(zhì)解折疊酶（unfoldase）的活性，而不是解聚酶（disassemblase），來參與核糖體大亞基的組裝。

高寧為該論文的通訊作者，課題組馬成英博士（現(xiàn)為昌平實驗室副研究員）、吳大木博士研究生（2017級PTN）為本文的共同第一作者，實習(xí)生陳倩同學(xué)（現(xiàn)就讀于浙江大學(xué)）在該工作中亦有貢獻(xiàn)。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、啟東-SLS創(chuàng)新基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國家重點實驗室的支持。北京大學(xué)冷凍電鏡平臺、電鏡實驗室、高性能計算平臺、生命科學(xué)學(xué)院儀器中心及鳳凰工程等多個儀器平臺對本項目提供了重要的技術(shù)支撐。

來源：北京大學(xué)