催產(chǎn)素（Oxytocin，OT）是一種由九個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽，在哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。催產(chǎn)素主要由位于下丘腦室旁核（paraventricular nucleus，PVN）和視上核（supraoptic nucleus，SON）的催產(chǎn)素能神經(jīng)元合成，并被儲(chǔ)存于大致密核心囊泡（large dense-core vesicle，LDCV）中。催產(chǎn)素一方面通過(guò)垂體后葉釋放進(jìn)入血液循環(huán)，調(diào)節(jié)分娩和哺乳行為；另一方面通過(guò)胞體樹(shù)突和投射到其他腦區(qū)的軸突末梢釋放到大腦中，調(diào)節(jié)配偶結(jié)合、母嬰關(guān)系和社會(huì)認(rèn)知等重要社會(huì)行為。OT通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族的催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor，OTR）發(fā)揮功能，OT/OTR信號(hào)的失調(diào)與焦慮、自閉癥和精神分裂癥等多種負(fù)性情緒和精神疾病緊密相關(guān)。盡管催產(chǎn)素參與上述諸多生理病理過(guò)程，并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，但其在體內(nèi)釋放的時(shí)空動(dòng)態(tài)及分子機(jī)制尚不明晰，主要技術(shù)瓶頸在于缺乏靈敏、特異、非侵入式、且具有高時(shí)空分辨率的探針，用以追蹤其動(dòng)態(tài)變化。

2023年1月2日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍教授實(shí)驗(yàn)室在Nature Biotechnology期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為“A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments”的研究論文，報(bào)道了新型可遺傳編碼的催產(chǎn)素?zé)晒馓结楪RABOT1.0及其在活體動(dòng)物中的應(yīng)用；結(jié)合新的工具，本文深入探究了催產(chǎn)素釋放的分子機(jī)制。李毓龍實(shí)驗(yàn)室一直致力于系統(tǒng)性地發(fā)展神經(jīng)化學(xué)分子的檢測(cè)技術(shù)，先后開(kāi)發(fā)了針對(duì)膽堿類(lèi)、單胺類(lèi)、嘌呤類(lèi)和脂類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)的熒光探針，此次報(bào)道的GRABOT1.0是該系列的第一個(gè)神經(jīng)肽類(lèi)熒光探針，進(jìn)一步拓展了GRAB熒光探針家族。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)新型催產(chǎn)素?zé)晒馓结?揭秘神經(jīng)肽的時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控-肽度TIMEDOO

論文截圖

在這一工作中，李毓龍實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用GRAB探針策略 (GPCR-ActivationBased Sensor)，將循環(huán)重排的綠色熒光蛋白cpGFP嫁接到催產(chǎn)素受體OTR的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)，通過(guò)對(duì)不同物種來(lái)源的OTR的篩選和連接肽段的系統(tǒng)優(yōu)化，最終基于牛的催產(chǎn)素受體（bovine OTR）開(kāi)發(fā)得到了表現(xiàn)最好的OT熒光探針GRABOT1.0（簡(jiǎn)稱(chēng)為OT1.0）。在體外培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞和原代神經(jīng)元中，OT1.0探針表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞膜定位。神經(jīng)元表達(dá)的OT1.0探針對(duì)外源加入的催產(chǎn)素有~450%的熒光信號(hào)響應(yīng)（ΔF/F0）和~3nM的親和力（EC50）（圖1）。此外，OT1.0探針能夠在亞秒級(jí)（~0.5s）時(shí)間尺度上響應(yīng)胞外OT濃度變化，且?guī)缀醪患せ頖PCR下游信號(hào)通路，因而對(duì)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)沒(méi)有明顯影響。

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圖1. OT1.0探針在HEK293T細(xì)胞和原代培養(yǎng)神經(jīng)元上的表現(xiàn)

那么OT1.0是否能用于檢測(cè)內(nèi)源催產(chǎn)素的釋放呢？作者借助AAV病毒將OT1.0探針表達(dá)在催產(chǎn)素能神經(jīng)元軸突投射的中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA），成功記錄到小鼠急性腦切片中電刺激引起的軸突OT釋放。此外，作者發(fā)現(xiàn)下丘腦室旁核（PVN）胞體樹(shù)突釋放的催產(chǎn)素也能被OT1.0探針檢測(cè)到。有意思的是，進(jìn)一步的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明催產(chǎn)素在胞體和軸突末梢的釋放是依賴(lài)于截然不同的鈣通道：OT在胞體樹(shù)突的釋放主要由L型電壓門(mén)控鈣通道介導(dǎo)，而其在軸突末梢的釋放則主要由N型電壓門(mén)控鈣通道介導(dǎo)（圖2）。

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圖2. OT1.0探針在小鼠急性腦切片中檢測(cè)內(nèi)源催產(chǎn)素的釋放

前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）作為社交行為的關(guān)鍵腦區(qū)，表達(dá)催產(chǎn)素受體并接受PVN中OT神經(jīng)元的軸突投射。為了研究OT1.0探針能否用于報(bào)告活體動(dòng)物腦中催產(chǎn)素的動(dòng)態(tài)變化，作者首先在OT神經(jīng)元中特異地表達(dá)光遺傳學(xué)工具ChrimsonR，并在PFC中表達(dá)OT1.0探針。運(yùn)用光纖記錄技術(shù)，作者成功在自由活動(dòng)的小鼠中檢測(cè)到OT神經(jīng)元激活引起的催產(chǎn)素釋放。進(jìn)一步運(yùn)用OT1.0探針記錄雄鼠交配過(guò)程中各腦區(qū)的胞外催產(chǎn)素水平，作者發(fā)現(xiàn)OT信號(hào)在交配行為的不同階段存在腦區(qū)特異的動(dòng)態(tài)變化（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了OT1.0探針在體應(yīng)用時(shí)具備高靈敏度、優(yōu)異的信噪比和快速的動(dòng)力學(xué)。

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圖3. OT1.0探針報(bào)告自由活動(dòng)的小鼠在光遺傳激活及交配行為時(shí)大腦中的催產(chǎn)素信號(hào)

綜上所述，在這項(xiàng)工作中，作者開(kāi)發(fā)了新型遺傳編碼的催產(chǎn)素?zé)晒馓结槪瑢?shí)現(xiàn)了體外和在體情況下對(duì)胞外催產(chǎn)素的高時(shí)空分辨率的記錄，并報(bào)道了催產(chǎn)素在神經(jīng)元軸突末梢和胞體樹(shù)突兩種釋放模式的分子機(jī)制異同點(diǎn)，為理解神經(jīng)肽功能的復(fù)雜性提供了新的參考。

值得一提的是，李毓龍課題組近期還發(fā)展了多種神經(jīng)肽類(lèi)的GRAB熒光探針，包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）、生長(zhǎng)抑素（SST）、膽囊收縮素（CCK）,血管活性腸肽（VIP）,神經(jīng)降壓素（NTS）和神經(jīng)肽Y（NPY）等（Wang H et al.,bioRxiv, 2022）。此外，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Tommaso Patriarchi團(tuán)隊(duì)和日本金澤大學(xué)的DaisukeIno團(tuán)隊(duì)也分別開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)食欲素和催產(chǎn)素的熒光探針OxLight1（Duffet L et al., Nature Methods, 2022）和MTRIAOT（Ino D et al., Nature Methods, 2022）。相信這些新型成像工具的開(kāi)發(fā)，將會(huì)在分子和神經(jīng)環(huán)路層面推動(dòng)科研人員更加深入地理解神經(jīng)肽信號(hào)傳遞在生理和病理?xiàng)l件下的功能和調(diào)控機(jī)理。

李毓龍為本文通訊作者；北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生錢(qián)統(tǒng)瑞、博士畢業(yè)生王歡和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院的王鵬博士為本論文的共同第一作者；北京大學(xué)博士研究生耿嵐、王蕾等對(duì)文章作出了重要貢獻(xiàn)。該工作得到了北京腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心羅敏敏實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)紐約大學(xué)的Dayu Lin實(shí)驗(yàn)室，瑞士洛桑大學(xué)的Ron Stoop實(shí)驗(yàn)室，以及德國(guó)海德堡大學(xué)的Valery Grinevich實(shí)驗(yàn)室的通力合作，并得到了北京大學(xué)膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市科委、深港腦科學(xué)創(chuàng)新研究院、峰基金等機(jī)構(gòu)和經(jīng)費(fèi)的大力支持。

更多李毓龍實(shí)驗(yàn)室工作詳見(jiàn)：http://yulonglilab.org/

來(lái)源：北京大學(xué)