新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）利用其包膜上的三聚體刺突（spike）蛋白與宿主細胞ACE2受體結(jié)合以介導(dǎo)病毒的入侵（視頻1）。由于在感染過程中的重要作用，spike蛋白是疫苗和抗體藥物研發(fā)的主要靶標。盡管國內(nèi)外已有針對spike蛋白的批準或緊急使用授權(quán)的疫苗、抗體藥物用于臨床，但隨著變異株的不斷出現(xiàn)及流行，尤其是spike蛋白成為突變熱點，對疫苗的保護率和抗體藥物的治療效果提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。相比抗體藥物而言，小分子藥物具有對突變不敏感、可口服給藥、生產(chǎn)運輸成本低等潛力，是一種有前景的新冠病毒治療方案。目前沒有針對spike蛋白的小分子候選化合物進入臨床研究，多角度開發(fā)新冠病毒的新型預(yù)防和治療藥物仍刻不容緩。

這三年來，肆虐全球的新冠病毒變化多端，從原始株開始，演化出阿爾法、貝塔、伽馬、德爾塔，直到現(xiàn)在奧密克戎又成為最流行毒株，還分化出不同亞型，至于將來如何變幻，難以預(yù)料。但萬變不離其宗，新冠病毒再變幻無窮，也仍然遵循病毒的生活史，遵循吸附、進入、脫殼、復(fù)制、成熟和釋放的生命周期。針對新冠病毒進行的新藥研發(fā)也是圍繞著這幾個關(guān)鍵節(jié)點進行。抑制已入侵細胞的病毒復(fù)制已有多個小分子藥物批準上市或者緊急使用授權(quán)，如3CL蛋白酶抑制劑Paxlovid和Ensitrelvir，如RdRp抑制劑Remdesivir和Molnupiravir。但直接阻斷新冠病毒進入細胞的途徑，尚未有一款小分子藥物進入臨床研究，雖然這條途徑已經(jīng)被抗體和疫苗驗證了其可行性，但這類生物藥卻經(jīng)常因為新冠病毒spike蛋白變異而失效。2020年Toelzer等人在Science等雜志連續(xù)發(fā)文，發(fā)現(xiàn)spike蛋白雖然多變，卻具有一個非常保守的游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）結(jié)合位點，調(diào)控該位點可以有效地抑制病毒進入細胞，稱其為新冠的阿喀琉斯之踵。可惜的是，因為其結(jié)合位點的特殊性，只報道過幾個偶然發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物，尚未找到可成藥的小分子。

那么，面對新冠多變的spike蛋白，以不變應(yīng)萬變，是否可以通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，精確地靶向新冠病毒的七寸——游離脂肪酸結(jié)合位點——射出這一箭？

2023年2月8日，北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院黃牛實驗室與天津大學(xué)藥學(xué)院黃劍輝教授及水木未來（北京）科技有限公司合作，在美國化學(xué)會旗艦雜志ACS Central Science雜志上發(fā)表題為“In Silico Discovery of Small Molecule Modulators Targeting the Achilles’ Heel of SARS-CoV-2 Spike Protein”的文章。該研究針對SARS-CoV-2 spike蛋白保守的游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）結(jié)合位點，通過大規(guī)模虛擬篩選策略發(fā)現(xiàn)苗頭化合物并隨后對其進行優(yōu)化，得到一系列低摩爾級別結(jié)合活性的小分子化合物。隨后冷凍電鏡研究確定了小分子在FFA結(jié)合位點的結(jié)合模式，并且揭示了小分子的結(jié)合使spike蛋白的構(gòu)象平衡向“閉合”狀態(tài)方向轉(zhuǎn)變，即無法與ACE2受體結(jié)合的構(gòu)象狀態(tài)。該研究在一定程度上表明針對保守的FFA結(jié)合位點發(fā)現(xiàn)的小分子調(diào)節(jié)劑有望開發(fā)成為預(yù)防和治療冠狀病毒的廣譜藥物，并且聯(lián)合其他作用機制的藥物如3CL蛋白酶抑制劑等，達到雞尾酒療法的效果。

1. “新藥發(fā)現(xiàn)的源泉”——生物學(xué)新機制

新藥研發(fā)的源泉是新的生物學(xué)機制/新靶點。SARS-CoV-2利用其包膜上的三聚體spike蛋白與宿主細胞ACE2受體結(jié)合以介導(dǎo)病毒的入侵。融合前的spike蛋白主要有兩種構(gòu)象狀態(tài)，一種是三個受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD）都處于“向下”構(gòu)象的“閉合”狀態(tài)（圖1A），另一種是有一個或多個RBD處于“向上”構(gòu)象的“開放”狀態(tài)，而只有“向上”構(gòu)象的RBD才能與ACE2結(jié)合（圖1B）。與新冠病毒原始株相比，計算模擬及結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究均表明近期流行的奧密克戎變異株的spike蛋白構(gòu)象更偏好與ACE2結(jié)合的“開放”狀態(tài)，這在一定程度上解釋了奧密克戎毒株傳播性更強的現(xiàn)象。

圖1 融合前spike蛋白的兩種構(gòu)象狀態(tài)：“閉合”（左）和“開放”（右）

Toelzer等人在電鏡研究中意外發(fā)現(xiàn)亞油酸分子結(jié)合在三個由spike蛋白中的兩個相鄰RBDs組成的復(fù)合型結(jié)合口袋中。與apo spike相比，亞油酸的結(jié)合使得spike蛋白中三個RBDs之間的結(jié)合更加緊密，將spike構(gòu)象鎖定在無法與ACE2結(jié)合的“閉合”狀態(tài)。隨后，北京生命科學(xué)研究所的鄭三多實驗室也有類似發(fā)現(xiàn)。本研究團隊對此FFA結(jié)合位點氨基酸殘基的保守性進行了分析，發(fā)現(xiàn)除R408外，其他殘基都高度保守，保守性遠遠高于與ACE2結(jié)合界面處的殘基（圖2）。這啟發(fā)研究團隊，針對此保守的FFA結(jié)合位點開發(fā)小分子調(diào)節(jié)劑，有望以變構(gòu)調(diào)節(jié)的方式改變spike蛋白的構(gòu)象偏好，進而干擾病毒侵染細胞的過程。

圖2 （A）FFA結(jié)合位點殘基與（B）ACE2結(jié)合界面處殘基的保守性比較

2. “雪中送炭”——基于靶標結(jié)構(gòu)的虛擬篩選

解決傳統(tǒng)方法很難解決的問題，是新技術(shù)的重要價值所在。開發(fā)spike蛋白的小分子構(gòu)象調(diào)節(jié)劑，難以通過建立高通量實驗篩選方法進行，因此基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法成為尋找FFA結(jié)合位點小分子配體的一把利器。研究團隊針對FFA結(jié)合口袋，利用黃牛實驗室多年發(fā)展的逐級虛擬篩選技術(shù)（圖3），先對北生所內(nèi)部的化合物庫（32余萬分子）進行分子對接，接著對打分排名前6萬的化合物做更高計算精度的基于MM-GB/SA方法的優(yōu)化及重打分，隨后系統(tǒng)分析打分排名前1000的化合物結(jié)合模式，最終挑取了54個化合物做SPR實驗驗證（圖3A）。結(jié)果表明，6個化合物顯示微摩爾級別的結(jié)合活性（圖3B）。為了提高化合物的活性及溶解性，在經(jīng)過可合成性評估后，研究團隊合成了SPC-2的含羧基基團的類似物，得到結(jié)合活性為4.8微摩爾的化合物（圖4）。并且，這類化合物對奧密克戎BA.4（spike蛋白包含R408S突變）也表現(xiàn)出類似結(jié)合活性，表明化合物的結(jié)合不受R408突變的影響。這個結(jié)果，除再次驗證了我們計算技術(shù)的實戰(zhàn)能力之外，也在一定程度上佐證了我們“以不變應(yīng)萬變”的策略，用小分子調(diào)控保守的FFA結(jié)合口袋，針對易突變的新冠病毒具有一定的優(yōu)勢。

恰如黃牛實驗室最近在Int J Mol Sci應(yīng)邀發(fā)表的綜述性論文中強調(diào)的，虛擬篩選技術(shù)只有被用在新靶標上，發(fā)現(xiàn)生物活性分子作為先導(dǎo)化合物進行后繼開發(fā)，或作為化學(xué)探針來研究細胞和生物體中的靶標功能，才能為新藥研發(fā)做出“雪中送炭”的實質(zhì)性貢獻（https://mp.weixin.qq.com/s/DmNxdfAfUnew3l-Y6GL4Yw）。

圖3 （A）逐級虛擬篩選策略流程圖及其（B）發(fā)現(xiàn)的苗頭化合物

圖4 苗頭化合物的SAR研究

3. “有圖有真相” ——復(fù)合物結(jié)構(gòu)的測定

為了確定化合物的結(jié)合模式及其對spike蛋白構(gòu)象偏好的影響，研究團隊將純化的spike蛋白與含羧基化合物SPC-14（K_D = 9.5 μM）一起孵育制備冷凍電鏡樣品，并以單獨的spike蛋白體系作為空白對照。電鏡結(jié)果表明，對于有SPC-14加入的體系，約48%的粒子處于“關(guān)閉”狀態(tài)，另外52%處于有一個RBD向上的“開放”狀態(tài)。而對于apo spike體系，幾乎100% 都處于一個RBD向上的“開放”狀態(tài)，這表明SPC-14的加入會影響spike蛋白的構(gòu)象偏好（圖5A）。同時，在“關(guān)閉”狀態(tài)的spike+SPC-14體系中發(fā)現(xiàn)了多余的電子云密度，此密度正好位于FFA結(jié)合位點并且SPC-14的分子結(jié)構(gòu)能夠很好的與其契合（圖5B）。

圖5（A）spike蛋白在有無SPC-14加入下的冷凍電鏡密度圖。（B）spike蛋白與SPC-14復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)。

4. “路漫漫其修遠兮” ——未來可期

綜上，此研究首次利用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選手段發(fā)現(xiàn)并且實驗驗證了一系列對spike蛋白有結(jié)合活性的小分子，在傳統(tǒng)實驗篩選方法很難解決的情況下，計算可謂起到了雪中送炭的作用。雖然早在2020年底就已完成虛擬篩選計算工作，區(qū)別于新冠病毒爆發(fā)早期的很多沒有實驗驗證的計算研究，該研究結(jié)合SPR測活和最終通過電鏡結(jié)構(gòu)解析的實驗手段進行了嚴謹?shù)尿炞C工作?！奥仿湫捱h兮”，盡管該研究己發(fā)現(xiàn)了一系列低微摩爾級別的spike蛋白小分子調(diào)節(jié)劑，但結(jié)合活性有待進一步提升，小分子對變異毒株的構(gòu)象偏好影響也有待研究，抗病毒功能也亟待驗證?；谠撗芯恐幸呀?jīng)解析的小分子與spike蛋白的復(fù)合物電鏡結(jié)構(gòu)，該研究團隊迅速開展分子優(yōu)化改造，新合成的10多個化合物，結(jié)合活性已有近十倍的提升，進一步的電鏡結(jié)構(gòu)解析和化合物優(yōu)化工作正在進行；針對spike蛋白上其它潛在小分子結(jié)合位點的虛擬篩選和實驗驗證工作也已開展?？茖W(xué)就是在一點一滴的進步中實現(xiàn)超越，希望本研究工作能激發(fā)更多的針對新冠病毒新機制、新靶標的小分子研發(fā)工作，畢竟基礎(chǔ)研究的使命是探索未知、原始創(chuàng)新。希望靶向spike蛋白的小分子藥物將為預(yù)防和治療冠狀病毒的工具箱提供更多的選擇！

黃牛實驗室的博士研究生王情與水木未來的孟繁昊為本文共同第一作者，黃牛博士與天津大學(xué)的黃劍輝教授為通訊作者。其他作者包括黃牛實驗室的謝鈺婷和劉濤，鄭三多博士與其實驗室的王巍博士，水木未來的倪曉丹博士，以及中國科學(xué)院微生物研究所的齊建勛博士及其實驗室的孟玉敏，李霖杰。該研究由北京市科委（生命科學(xué)前沿創(chuàng)新培育項目）和清華大學(xué)共同資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01190

來源：北京生命科學(xué)研究所