2023年3月2日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院陳鵬教授研究團(tuán)隊(duì)與生命科學(xué)學(xué)院季雄教授課題組在《細(xì)胞》（ Cell ）雜志發(fā)表了題為“Linking chromatin acylation mark-defined proteome and genome in living cells”的研究論文，發(fā)展了在活細(xì)胞內(nèi)“關(guān)聯(lián)解析”蛋白質(zhì)化學(xué)修飾機(jī)制與功能的“單位點(diǎn)-多組學(xué)”技術(shù)-SiTomics，揭示了受染色質(zhì)?；揎椊閷?dǎo)的豐富的相互作用組學(xué)信息，建立了表觀遺傳調(diào)控的蛋白質(zhì)組與基因組“信息關(guān)聯(lián)”。

1988年，加州大學(xué)洛杉磯分校Michael Grunstein教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞中的核小體不僅僅是供DNA纏繞的結(jié)構(gòu)，它在調(diào)節(jié)基因表達(dá)上還有著重要作用¹。此后，隨著表觀遺傳學(xué)先驅(qū)David Allis教授在1996年對(duì)組蛋白尾部修飾酶的突破性發(fā)現(xiàn)²和2001年提出的Histone Code假說(shuō)³，人們對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間關(guān)系的理解進(jìn)入了嶄新的一頁(yè)。在一系列組蛋白新修飾被鑒定⁴的同時(shí)，人們迫切地想知道這些特異性修飾的性質(zhì)和功能有何異同，又是如何調(diào)控基因表達(dá)的？例如，越來(lái)越多的證據(jù)表明，來(lái)自環(huán)境的代謝物會(huì)通過(guò)染色質(zhì)的化學(xué)修飾實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控⁵，但作為表觀遺傳調(diào)控的重要分子基礎(chǔ)，人們對(duì)很多化學(xué)修飾，尤其是位點(diǎn)特異、雙向可逆的動(dòng)態(tài)修飾對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響尚不清楚，亟需對(duì)這些多層次的表觀遺傳信息加以解析和關(guān)聯(lián)。

論文截圖

傳統(tǒng)的生物學(xué)方法往往借助抗體的特異識(shí)別來(lái)原位研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，而化學(xué)生物學(xué)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)活體環(huán)境下的高選擇性和時(shí)空特異研究，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在這一工作中，作者借助遺傳密碼子拓展策略，發(fā)展了一種具有單氨基酸位點(diǎn)分辨率的多組學(xué)技術(shù)Single-site-resolved multi-omics（SiTomics，圖1）。通過(guò)將一系列帶有賴氨酸?；揎椀摹肮饨宦?lián)”非天然氨基酸，以位點(diǎn)特異的方式引入活細(xì)胞內(nèi)的組蛋白當(dāng)中，原位模擬內(nèi)源修飾在基因組上的分布，并與蛋白質(zhì)光交聯(lián)和組學(xué)鑒定技術(shù)、基因組測(cè)序技術(shù)等相結(jié)合，他們系統(tǒng)性地開(kāi)展了由位點(diǎn)特異的化學(xué)修飾介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)組與基因組“關(guān)聯(lián)鑒定”。利用SiTomics技術(shù)，他們首先鑒定出H3K56位點(diǎn)在短鏈脂肪酸代謝物的刺激下會(huì)發(fā)生顯著的?；揎?，進(jìn)而獲得了受H3K56?；揎椊閷?dǎo)的相互作用蛋白質(zhì)組和基因組，建立了二者之間的直接關(guān)聯(lián)。他們的工作還揭示了超級(jí)增強(qiáng)子（super-enhancer）在細(xì)胞“代謝-修飾-基因轉(zhuǎn)錄”調(diào)控軸中發(fā)揮的重要作用。

圖1“關(guān)聯(lián)解析”染色質(zhì)動(dòng)態(tài)修飾機(jī)制與功能的“單位點(diǎn)-多組學(xué)”技術(shù)-SiTomics（Single-site-resolved multi-omics）。I. Site-Profiling: 單位點(diǎn)修飾的動(dòng)態(tài)變化情況的比較, II. Site-Link:通過(guò)遺傳密碼子拓展技術(shù)在組蛋白上引入K*acyl，利用光交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定單位點(diǎn)修飾的相互作用蛋白質(zhì)組, III. Site-Seq：通過(guò)遺傳密碼子拓展技術(shù)在組蛋白上引入Kacyl，結(jié)合傳統(tǒng)ChIP-seq技術(shù)研究具有修飾的核小體在基因組中所處的位置

“單位點(diǎn)分辨”的動(dòng)態(tài)修飾定量鑒定

組蛋白修飾位點(diǎn)眾多，不同位點(diǎn)對(duì)代謝物響應(yīng)程度的定量比較，會(huì)因不同多肽對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的差異而難以實(shí)現(xiàn)。在之前的研究中，人們往往利用同位素標(biāo)記的代謝物處理細(xì)胞并鑒定同位素標(biāo)記的修飾肽段，但這樣的方法會(huì)損失一些動(dòng)態(tài)變化信息，尤其是對(duì)修飾量減少或者原有修飾經(jīng)擦除后重新被修飾的情況，都難以提供豐度信息。利用SILAC技術(shù)標(biāo)記賴氨酸和精氨酸，整合平行比較同樣長(zhǎng)度、修飾和電荷數(shù)的同一肽段的變化情況，可以更為精準(zhǔn)地定量比較修飾的動(dòng)態(tài)變化（Site-Profiling, I）。最終，通過(guò)加權(quán)分析，作者鑒定出H3K56位點(diǎn)在短鏈脂肪酸（如巴豆酸、β-羥基丁酸）處理下都顯著地發(fā)生了相應(yīng)的酰化修飾。

“非天然氨基酸”可于活細(xì)胞中“連接”表觀遺傳信息

如何在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)化學(xué)修飾的原位模擬？基于遺傳密碼子拓展的非天然氨基酸技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)正在于此。天然賴氨酸的光活性類似物-photolysine能夠維持修飾狀態(tài)與體內(nèi)的賴氨酸修飾一致（圖2），而遺傳密碼子拓展技術(shù)的生物“正交性”使得帶有翻譯后修飾的photolysine能夠定點(diǎn)特異地引入組蛋白當(dāng)中。借助這些“可遺傳編碼”的非天然氨基酸，帶有特異修飾的組蛋白就可以通過(guò)其末端的富集標(biāo)簽，結(jié)合“光交聯(lián)”蛋白組學(xué)技術(shù)（Site-Link, II）和傳染色體免疫共沉淀-測(cè)序技術(shù)（Site-Seq, III），實(shí)現(xiàn)其相互作用蛋白質(zhì)組及在染色體中定位的協(xié)同鑒定。

圖2 Photolysine模擬lysine，最小化結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)便于維持PTM的結(jié)構(gòu)基團(tuán)穩(wěn)定

那么，定點(diǎn)引入翻譯后修飾的組蛋白是否能夠穩(wěn)定存在并被整合入染色體當(dāng)中？被整合入染色體中的組蛋白修飾又去了什么樣的位置？有沒(méi)有干擾細(xì)胞內(nèi)原始的修飾狀態(tài)？和內(nèi)源產(chǎn)生的修飾在基因組的分布又是否一致？這樣得到的功能性發(fā)現(xiàn)又是否與實(shí)際狀態(tài)一致呢？為了回答這些問(wèn)題，作者設(shè)計(jì)、合成和開(kāi)發(fā)了分別含有6種修飾（Kac, Kpr, Kbu, Kcr, Khib, Kbhb；K*ac, K*pr, K*bu, K*cr, K*hib, K*bhb）或1種對(duì)照（PABK與PABK*,通過(guò)TCO小分子原位decage出無(wú)修飾的K與K*）的共計(jì)14個(gè)“非天然氨基酸”探針（圖3），均實(shí)現(xiàn)了組蛋白H3中相應(yīng)賴氨酸修飾位點(diǎn)的定點(diǎn)插入。利用一系列表征手段，分別對(duì)帶有特異修飾的組蛋白表達(dá)、分布位置、插入位點(diǎn)等進(jìn)行了確證。同時(shí)，利用重標(biāo)氨基酸探針確證了修飾基團(tuán)在細(xì)胞中的穩(wěn)定存在時(shí)間。這些詳實(shí)的數(shù)據(jù)確證了帶有定點(diǎn)翻譯后修飾的組蛋白能夠在活細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并被有效整合入染色體當(dāng)中。

圖3 本文所涵蓋和發(fā)展的14個(gè)“非天然氨基酸”編碼探針

互作蛋白質(zhì)組與染色質(zhì)分布的“協(xié)同解析”

作者將Site-Link技術(shù)應(yīng)用于H3蛋白的K37, K56和K79等位點(diǎn)（H3K*56ac，H3K*56cr，H3K*56bhb，H3K*56PABK*，H3K*37cr，H3K*79cr），利用對(duì)這些帶有光交聯(lián)探針的組蛋白進(jìn)行交聯(lián)-富集和質(zhì)譜鑒定，他們獲得了不同位點(diǎn)/修飾的相互作用蛋白質(zhì)組信息，發(fā)現(xiàn)不同“位點(diǎn)-修飾”組合的確具有獨(dú)特的相互作用蛋白質(zhì)組。

接下來(lái)，作者對(duì)巴豆?；揎椷M(jìn)行了細(xì)致的研究（圖4）。與H3K4me3一樣，賴氨酸的巴豆酰化修飾（Kcr）被報(bào)道分布于基因組啟動(dòng)子區(qū)域。將SiTomics技術(shù)應(yīng)用于H3K56cr的研究，作者確實(shí)捕獲到一系列報(bào)道與H3K4me3相互作用的蛋白質(zhì)，且隨機(jī)選取H3K4me3在基因組中分布的位點(diǎn)能夠驗(yàn)證H3K56cr也分布在這些位置。另外，他們發(fā)現(xiàn)H3K56cr具有一個(gè)非常特異的相互作用蛋白-GLYR1，與H3K56位的其他修飾基本都沒(méi)有結(jié)合作用。鑒于之前的報(bào)道顯示GLYR1分布在基因體（gene body）區(qū)域，作者推斷GLYR1可能與巴豆?；趃ene body的相對(duì)高豐度分布有關(guān)。進(jìn)一步利用“時(shí)間分辨”的光交聯(lián)技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)在H3K56cr表達(dá)量穩(wěn)定后，GLYR1與之的結(jié)合會(huì)逐步增加，這在一定程度上解釋了H3K56cr是先被整合進(jìn)入基因組中，再與GLYR1產(chǎn)生相互作用。在得到這些信息之后，作者推斷細(xì)胞中可能存在著“正交”的“識(shí)別-裝載”系統(tǒng)，能夠協(xié)助這些攜帶有翻譯后修飾的組蛋白整合進(jìn)入染色體的相應(yīng)位置，從而使這些組蛋白能夠“重現(xiàn)”內(nèi)源修飾在基因組上的分布，其獲得的組學(xué)數(shù)據(jù)便是染色質(zhì)化的蛋白質(zhì)組和基因組學(xué)信息。為驗(yàn)證這一論斷，作者隨即對(duì)賴氨酸的β-羥基丁?；揎棧↘bhb）進(jìn)行了更為系統(tǒng)的研究。

圖4 SiTomics技術(shù)“協(xié)同解析”受H3K56cr介導(dǎo)的“染色質(zhì)化（Chromatinized）”相互作用蛋白質(zhì)組與基因組

β-羥基丁?；桥c“生酮飲食法”（Keto Diet）最為密切的一個(gè)化學(xué)修飾，但目前對(duì)其的研究報(bào)道甚少。將Site-Seq技術(shù)應(yīng)用于β-羥基丁?；?，作者發(fā)現(xiàn)帶有H3K56bhb修飾的組蛋白并非隨機(jī)地分布在染色體中，而無(wú)修飾的H3K56則相對(duì)隨機(jī)分布。H3K56bhb確實(shí)可以增加一些位置的染色體的開(kāi)放性。進(jìn)一步的Hi-C測(cè)序發(fā)現(xiàn)，單位點(diǎn)修飾的H3K56bhb便足以引起染色體三維結(jié)構(gòu)的變化（圖5）。

圖5 H3K56bhb單位點(diǎn)修飾對(duì)三維基因組的影響

“單位點(diǎn)-多組學(xué)”技術(shù)揭示生理情況的染色體調(diào)控

在確認(rèn)了工具對(duì)生理狀態(tài)的模擬之后，作者接下來(lái)將其應(yīng)用于酮體代謝下的染色體調(diào)控研究。他們首先通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)酮體代謝下的β-羥基丁?；揎椩诩?xì)胞核中呈現(xiàn)特異的聚集樣分布，這可能預(yù)示著細(xì)胞核中獨(dú)特的調(diào)控作用。那么，如何快速尋找切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這樣的生物學(xué)表型所對(duì)應(yīng)的調(diào)控機(jī)制呢？他們所開(kāi)發(fā)的“單位點(diǎn)-多組學(xué)”工具此時(shí)便有利于開(kāi)啟這樣的探索。鑒于之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酮體代謝情況下，H3K56bhb修飾顯著增加，則可利用SiTomics工具研究H3K56bhb的相互作用蛋白，并考察在基因組上是否存在特異分布。

的確，作者發(fā)現(xiàn)H3K56bhb與BRD4存在相互作用，同時(shí)，H3K56bhb在超級(jí)增強(qiáng)子中有顯著分布（圖6），而作為對(duì)照的H3K9bhb則幾乎沒(méi)有分布。作者因此推測(cè)可能酮體代謝情況下的染色體調(diào)控有超級(jí)增強(qiáng)子的參與。

圖6 Site-Seq 分析H3K56bhb在基因組的特異分布

最后，通過(guò)利用Nabhb處理細(xì)胞、模擬酮體代謝下細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)動(dòng)態(tài)調(diào)控情況，作者發(fā)現(xiàn)，超級(jí)增強(qiáng)子的確發(fā)生了顯著變化，而且與H3K56bhb的基因組整合位點(diǎn)相一致。此外，β-羥基丁酸處理下，受影響的超級(jí)增強(qiáng)子附近的基因其Pol II結(jié)合增加，而在H3K56bhb引入的細(xì)胞中，這些基因附近的Pol II結(jié)合也明顯增加。進(jìn)一步的RNA-seq分析證實(shí)這些發(fā)生變化的超級(jí)增強(qiáng)子可以幫助解釋代謝情況下相關(guān)基因的高表達(dá)現(xiàn)象，從而在分子水平上實(shí)現(xiàn)了“代謝-修飾-調(diào)控”軸的貫穿（圖7）。

圖7 SiTomics解析代謝情況下H3K56bhb定點(diǎn)修飾對(duì)細(xì)胞超級(jí)增強(qiáng)子的影響

綜上所述，SiTomics技術(shù)為“關(guān)聯(lián)解析”染色質(zhì)動(dòng)態(tài)修飾的機(jī)制與功能、系統(tǒng)建立和解碼表觀遺傳“關(guān)聯(lián)信息”提供了多組學(xué)研究平臺(tái)，并可適用于組蛋白之外的蛋白質(zhì)和?；揎椫獾幕瘜W(xué)修飾，為深入開(kāi)展蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)修飾的機(jī)制研究、開(kāi)發(fā)相應(yīng)的化學(xué)干預(yù)策略提供了強(qiáng)大的工具平臺(tái)。

陳鵬、季雄、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心畢業(yè)生秦芳菲博士是本文的共同通訊作者；秦芳菲和生命科學(xué)學(xué)院李伯源博士是共同第一作者。文章返修過(guò)程正值北京疫情高峰期，多名同學(xué)貢獻(xiàn)了自己寶貴的科研時(shí)間，展現(xiàn)了團(tuán)結(jié)協(xié)作的風(fēng)貌。

何川教授（HHMI、芝加哥大學(xué)）點(diǎn)評(píng)：

表觀遺傳研究近年來(lái)正在迅猛發(fā)展，DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白的翻譯后修飾、RNA可逆修飾7等都是表觀遺傳信息的重要載體（https://www.genome.gov/genetics-glossary/Epigenetics）。如何系統(tǒng)性地揭示環(huán)境與表型之間由表觀遺傳介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)關(guān)系，深入研究其分子機(jī)理，這就需要各種基因組學(xué)、成像和其它有效的方法的結(jié)合。表觀遺傳調(diào)控本質(zhì)是生物大分子上化學(xué)動(dòng)態(tài)修飾的問(wèn)題?；瘜W(xué)的方法來(lái)研究表觀遺傳應(yīng)該有巨大前景。這篇文章提供了一個(gè)非常好的例子。其理論基礎(chǔ)就是過(guò)去20多年廣泛發(fā)展起來(lái)的生物正交反應(yīng)體系。比如2022年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了點(diǎn)擊化學(xué)與生物正交反應(yīng)，簡(jiǎn)單的炔基與疊氮基團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)，與生物體系兼容且正交，為很多生物學(xué)新發(fā)現(xiàn)提供了有效的工具。此次陳鵬團(tuán)隊(duì)與合作者的這個(gè)工作實(shí)現(xiàn)了利用遺傳密碼子拓展技術(shù)將組蛋白化學(xué)修飾定點(diǎn)“編碼”到活細(xì)胞的染色質(zhì)當(dāng)中。他們系統(tǒng)分析了這些外源引入的化學(xué)修飾與生物體系內(nèi)源修飾的正交性，同時(shí)利用光交聯(lián)的化學(xué)手段研究相互作用蛋白質(zhì)組，并結(jié)合傳統(tǒng)生物學(xué)測(cè)序技術(shù)鑒定基因組信息，展示了這個(gè)技術(shù)的巨大前景。

1. 在技術(shù)發(fā)展方面，利用“遺傳密碼子拓展”策略，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的“編碼”研究

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾通常都是“翻譯后”事件，目前只能依賴特異識(shí)別某個(gè)修飾的抗體加以原位研究，尤其對(duì)于不同位點(diǎn)的相同修飾，甚至同一位點(diǎn)上化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的不同修飾，經(jīng)常很難加以區(qū)分，更無(wú)法在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特異、原位的研究。通過(guò)使用化學(xué)合成的片段體外重組核小體可以對(duì)定點(diǎn)的組蛋白修飾開(kāi)展結(jié)構(gòu)和功能研究，但在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行定點(diǎn)修飾研究仍然受限。普林斯頓大學(xué)的Tom Muir教授開(kāi)發(fā)的intein技術(shù)雖然可以通過(guò)多肽/蛋白質(zhì)的胞外遞送在一定程度上實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)的研究，但是具有較多的局限性。遺傳密碼子拓展技術(shù)能夠?qū)⑦@些帶有修飾的氨基酸以“非天然氨基酸”的形式“編碼”到活細(xì)胞的組蛋白當(dāng)中，能夠?qū)崿F(xiàn)修飾類型和氨基酸位點(diǎn)的“精準(zhǔn)編程”，為表觀遺傳修飾研究提供了廣闊的天地。陳鵬團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)修飾的氨基酸可以被“編碼表達(dá)”到組蛋白的特定位點(diǎn)，而在染色質(zhì)整體水平上這些“精準(zhǔn)編碼”的組蛋白能夠維持穩(wěn)定并在生理?xiàng)l件下被有效地整合進(jìn)染色體當(dāng)中?；诖耍罅康慕M學(xué)數(shù)據(jù)也展示出染色體上這些結(jié)構(gòu)相近的化學(xué)修飾的特異性。這一技術(shù)對(duì)未來(lái)針對(duì)特定修飾功能或兩到多種修飾之間協(xié)同功能研究提供了一個(gè)普適平臺(tái)。

2. 實(shí)現(xiàn)了“單個(gè)位點(diǎn)-特定修飾”的染色質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)組-基因組“串聯(lián)解析”

陳鵬與合作者發(fā)現(xiàn)組蛋白在單個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的修飾變化就足以引發(fā)三維基因組的變化，為位點(diǎn)特異的組蛋白修飾調(diào)控高階3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能提供了有力的證據(jù)，也預(yù)示了這個(gè)技術(shù)的巨大前景。通過(guò)將SiTomics技術(shù)與ChIP-MS、ChIP-seq聯(lián)用，他們以染色體上特定位點(diǎn)的化學(xué)修飾為單元，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組、基因組的多層次“關(guān)聯(lián)研究”，通過(guò)光交聯(lián)同時(shí)可以在活體細(xì)胞里鑒定各種結(jié)合蛋白質(zhì)，這些在以往的傳統(tǒng)研究中是難以實(shí)現(xiàn)的。作者選擇圍繞顯著受代謝影響的H3K56進(jìn)行了各種功能研究，發(fā)現(xiàn)H3K56bhb在增強(qiáng)子上的調(diào)控作用，也展示了該技術(shù)在生物研究上的應(yīng)用。

該工作有助于我們?nèi)ダ斫馐芑瘜W(xué)修飾調(diào)控的蛋白質(zhì)組和基因組是如何相互影響，并最終影響基因轉(zhuǎn)錄的。我們希望這樣的化學(xué)生物學(xué)工具越來(lái)越多，同時(shí)期待文中所提供的大量數(shù)據(jù)信息能夠推動(dòng)更為深入的生物學(xué)機(jī)制研究。

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來(lái)源：北京大學(xué)