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Nature | 新的開(kāi)始：基于深度學(xué)習(xí)從頭設(shè)計(jì)合成人工熒光素酶-肽度TIMEDOO
圖 1 Nature 論文截圖
2023年2月22日，美國(guó)華盛頓大學(xué)的David Baker研究組在Nature發(fā)表題為“De novo design of luciferases using deep learning” 的研究工作（圖1）。Baker團(tuán)隊(duì)將此前他們?cè)诘鞍踪|(zhì)設(shè)計(jì)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)的多種方法進(jìn)行融合，使用基于深度學(xué)習(xí)的 “family-wide hallucination” 方法從頭設(shè)計(jì)出能特異性催化底物的熒光素酶LuxSit。這項(xiàng)工作從頭創(chuàng)建了具有高活性和特異性的生物酶催化劑，是計(jì)算酶設(shè)計(jì)的一項(xiàng)重要里程碑。
熒光素酶（Luciferase）是一種常見(jiàn)的生物發(fā)光酶，無(wú)需激發(fā)光，它能催化熒光素（Luciferin）在存在氧氣的條件下發(fā)光（圖2）。
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圖 2 熒光素酶催化熒光素氧化發(fā)光
熒光素酶催化熒光素發(fā)光的原理被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，特別是用于生物標(biāo)記、高通量篩選和生物成像等應(yīng)用中。而現(xiàn)在，熒光素酶的設(shè)計(jì)改造發(fā)展還存在一些困難: 已被鑒定的天然熒光素酶種類很少，識(shí)別底物的特異性不高，天然熒光素酶也不會(huì)識(shí)別具有更理想的光物理性質(zhì)的合成熒光素，一些熒光素酶需要多個(gè)二硫鍵來(lái)穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，因此在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊。因此，表達(dá)更穩(wěn)定、底物識(shí)別特異性更高的熒光素酶成為了研究發(fā)展的需要。而基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)從頭合成設(shè)計(jì)賦予了這項(xiàng)研究嶄新的可能。

在這項(xiàng)研究中，研究者以人工合成熒光素DTZ（diphenylterazine）作為研究的催化底物（圖3），因?yàn)樗哂懈吡孔赢a(chǎn)率、紅移發(fā)射、有利的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)以及發(fā)光無(wú)需輔因子等特點(diǎn)。

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圖 3 Diphenylterazine (DTZ) 是一種生物發(fā)光劑。Diphenylterazine 本身僅產(chǎn)生很少的背景，導(dǎo)致極好的信噪比
從頭設(shè)計(jì)酶需要將底物的結(jié)合口袋和催化底物的活性位點(diǎn)同時(shí)納入蛋白骨架。首先是對(duì)蛋白骨架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。研究人員將DTZ與4000個(gè)天然小分子結(jié)合蛋白進(jìn)行對(duì)接。他們發(fā)現(xiàn)nuclear transport factor?2（NTF2）蛋白骨架的折疊結(jié)構(gòu)和DTZ具有良好的形狀互補(bǔ)性，因此選擇NTF2蛋白家族的骨架結(jié)構(gòu)對(duì)DTZ的結(jié)合口袋做進(jìn)一步的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

此前，David Baker組曾報(bào)道了一系列從序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系出發(fā)的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)相關(guān)算法（圖4）?！癏allucination”方法指在序列空間中進(jìn)行采樣，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)優(yōu)化，從而產(chǎn)生有意義結(jié)構(gòu)的序列，這項(xiàng)方法保證了序列的多樣性；“Rosetta sequence-design approaches” 則是從目標(biāo)結(jié)構(gòu)出發(fā)，生成符合該結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，從而保證了結(jié)構(gòu)的特異性；而trRosetta用來(lái)做結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

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圖 4 David Baker團(tuán)隊(duì)此前報(bào)道相關(guān)算法
研究者融合使用上述三種方法，即 “family-wide hallucination”，從2000個(gè)天然NTF2的序列開(kāi)始，歷經(jīng)搜索、幻想與生成，獲得了1615個(gè)符合要求的骨架序列（圖5）。
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圖 5 熒光素酶骨架結(jié)構(gòu)的幻想設(shè)計(jì)
在蛋白骨架結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，研究者們繼續(xù)對(duì)催化底物的活性中心進(jìn)行設(shè)計(jì)。此前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，DTZ在負(fù)離子狀態(tài)下具有最佳的反應(yīng)活性，因此在骨架結(jié)構(gòu)上保留了一個(gè)固定的精氨酸以維持底物的負(fù)離子狀態(tài)。在對(duì)活性中心的設(shè)計(jì)上，研究者結(jié)合他們此前開(kāi)發(fā)的RifGen方法，來(lái)模擬底物周圍最佳的氨基酸結(jié)構(gòu)組合。將活性中心的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)與之前獲得的蛋白骨架對(duì)接，再通過(guò)引入疏水相互作用和氫鍵網(wǎng)絡(luò)來(lái)做進(jìn)一步的篩選，從50000個(gè)對(duì)接組合中最終篩選出7648個(gè)候選結(jié)構(gòu)（圖6）。
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圖 6 熒光素酶活性中心的設(shè)計(jì)
利用熒光素酶篩選系統(tǒng)（圖7），研究者們表達(dá)了上述7648個(gè)候選蛋白，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有3個(gè)成功顯示熒光素酶催化活性的蛋白酶，其中有一個(gè)活性最高的，它們將其命名為L(zhǎng)uxSit (取lux sit拉丁語(yǔ)中l(wèi)et light exist之義)。
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圖 7 熒光素酶篩選系統(tǒng)
隨后研究者將LuxSit蛋白表達(dá)純化，并對(duì)其生物物理性質(zhì)進(jìn)行鑒定（圖8）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LuxSit包含117個(gè)氨基酸，分子量約為13.9 kDa, 比已知的所有天然熒光素酶的分子量都小。trRosetta和Alphafold2對(duì)LuxSit的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)基本一致，在體外實(shí)驗(yàn)中它也能成功催化底物DTZ發(fā)光。至此研究者們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)人工熒光素酶的從頭合成。
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圖 8 LuxSit的生物物理性質(zhì)鑒定
在LuxSit的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究者們又針對(duì)另一種熒光素底物設(shè)計(jì)了酶催化劑，也成功的實(shí)現(xiàn)了底物發(fā)光的反應(yīng)；并對(duì)LuxSit設(shè)計(jì)了一些突變位點(diǎn)，以期獲得更高的催化活性，在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中也取得了明顯的改善（圖9）。
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圖 9 Luxsit的優(yōu)化設(shè)計(jì)
綜上，本文介紹了一種基于深度學(xué)習(xí)的“family-wide hallucination”方法，該方法生成大量理想化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中包含多種口袋形狀和編碼它們的設(shè)計(jì)序列。使用這些蛋白骨架成功設(shè)計(jì)了人工熒光素酶，這些酶具有很高的底物選擇特異性。這是從頭合成生物酶的一次成功實(shí)踐，這一經(jīng)驗(yàn)有望用于其他類型蛋白酶的設(shè)計(jì)中。這是我們?cè)O(shè)計(jì)改造生物酶的一個(gè)嶄新開(kāi)始。
原文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41586

-023-05696-3

參考文獻(xiàn)
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來(lái)源：北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心