越來越多表觀、代謝相關(guān)的酶在不同的生命過程中呈現(xiàn)了非經(jīng)典的兼職功能（Moonlighting functions）。RNA聚合酶的經(jīng)典功能是依據(jù)DNA模板生成RNA，但是對RNA聚合酶除了RNA生成之外的非經(jīng)典功能卻知之甚少。RNA聚合酶亞基的變異或者異常表達(dá)和不同組織的疾病密切相關(guān)，表明亞基自身的功能重要。先前的常規(guī)干擾手段如RNA干擾、基因敲除等需要較長時間，會產(chǎn)生大量二級效應(yīng)，因而很難確定RNA聚合酶的非經(jīng)典功能。

2023年3月15日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心季雄研究員課題組在Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題為“RNA Pol II preferentially regulates ribosomal protein expression by trapping disassociated subunits”的研究論文。該研究報(bào)道了RNA聚合酶亞基RPB3能夠通過CBC-PCF11和小延伸復(fù)合物特異性調(diào)控核糖體蛋白基因的3’末端加工的非經(jīng)典兼職功能機(jī)制，表明RNA聚合酶可以通過游離組分實(shí)現(xiàn)單功能酶到多功能酶的轉(zhuǎn)變，把不同的活性限制在全酶附近增加了基因表達(dá)效率，并且實(shí)現(xiàn)特異性調(diào)控。同時該研究提出的SDDS系統(tǒng)為其它復(fù)合體亞基的非經(jīng)典兼職功能研究提供了新工具。該工作被Molecular Cell雜志在同期“Meet the authors”專欄作為研究亮點(diǎn)采訪報(bào)道。

論文截圖

研究者首先利用染色質(zhì)組分的分子篩實(shí)驗(yàn)在多種哺乳動物細(xì)胞系中均檢測到獨(dú)立于Pol II全酶的RPB3，稱為disassociated RPB3（dRPB3）。隨后研究者設(shè)計(jì)了一種巧妙的策略——Specific Degradation of Dissociated Subunits，簡稱SDDS系統(tǒng)，該系統(tǒng)在RPB3 degron細(xì)胞的基礎(chǔ)上，將偶聯(lián)linker區(qū)的RPB3整合到內(nèi)源RPB1的終止密碼子前，得到純合的RPB1-linker-RPB3融合蛋白表達(dá)細(xì)胞，稱為dRPB3 degron細(xì)胞。理論上RPB3 degron細(xì)胞在化學(xué)分子吲哚乙酸（IAA）處理后可降解細(xì)胞內(nèi)全部RPB3，而dRPB3 degron細(xì)胞在IAA處理后，全酶中的RPB3可被RPB1偶聯(lián)的RPB3替代，維持了全酶的完整性，但會導(dǎo)致游離于全酶之外的RPB3被降解。因此通過比較dRPB3 degron細(xì)胞IAA處理前后的功能差異，即可闡釋游離RPB3的功能。

圖1. 游離RPB3（dRPB3）蛋白瞬時降解系統(tǒng)（SDDS）和RPB3蛋白瞬時降解系統(tǒng)建立

為了確認(rèn)SDDS系統(tǒng)是否正常工作，研究者們通過RNA-seq、ChIP-seq、ChIP-Western、IF等實(shí)驗(yàn)對dRPB3 degron細(xì)胞進(jìn)行了多個層面的質(zhì)量控制，結(jié)果顯示在RPB1末端偶聯(lián)linker-RPB3不影響Pol II全酶的功能，也不干擾對RPB1的蛋白互作和定位。RPB3 degron細(xì)胞在IAA處理后可導(dǎo)致RPB1與多種小亞基相互作用的減少，然而dRPB3 degron細(xì)胞在IAA處理后并不影響RPB1與小亞基的相互作用。同時搭配AlphaFold2的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，研究者認(rèn)為dRPB3 degron細(xì)胞在IAA處理后，正如所設(shè)想的方式，僅造成游離RPB3降解，全酶中的RPB3可被偶聯(lián)于RPB1末端的RPB3所代償，維持了全酶功能的完整性。

圖2. dRPB3瞬時降解造成特異性核糖體蛋白的3’末端加工障礙

隨后，研究者們開展了dRPB3、RPB3降解前后的RNA-seq、ChAR-seq實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，不同于RPB3降解后造成的部分基因表達(dá)下調(diào)，dRPB3的降解對基因表達(dá)幅度影響較小，卻可導(dǎo)致特異的RNA剪接錯誤和3’末端加工障礙，表明dRPB3參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。更有意思的是RNA3’末端加工障礙特異性富集在核糖體蛋白基因。代表新生轉(zhuǎn)錄組的TT-seq實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明dRPB3參與調(diào)控核糖體蛋白基因的RNA3’末端加工。

為了探究dRPB3調(diào)控RNA3’末端加工的分子機(jī)制，研究者根據(jù)ChIP-MS、ChIP-Western、ChIP-qPCR等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)游離RPB3可招募NCBP1、PCIF1、PCF11到PolII 全酶附近，幫助維持各蛋白與PolII全酶的互作，確保了轉(zhuǎn)錄的正常終止。隨后研究者通過蛋白結(jié)構(gòu)域基序分析，證明只保留RPB3前137個氨基酸的顯性負(fù)調(diào)控突變體——RPB3-N137，在不能組裝進(jìn)PolII全酶的前提下，依然能夠與NCBP1互作，而表達(dá)該突變體同樣造成內(nèi)源核糖體蛋白基因的3’末端加工障礙。更進(jìn)一步地，研究者利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測了游離RPB3對核糖體相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控作用，同樣發(fā)現(xiàn)游離RPB3對基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控具有核糖體蛋白基因特異性，并且依賴于PCF11及其識別的轉(zhuǎn)錄終止基序。這些結(jié)果證實(shí)了游離RPB3對核糖體基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控作用。

為了探究游離RPB3調(diào)控核糖體基因特異性的機(jī)制，研究者通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，發(fā)現(xiàn)dRPB3特異性影響3’末端加工的基因可以被LEC（Little Elongation Complex）小延伸復(fù)合物組分ELL2、AFF4在這些基因啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合水平解釋，而這兩者參與形成的小延伸復(fù)合物，先前被報(bào)道調(diào)控基因的3’末端加工。通過Co-IP和體外pulldown實(shí)驗(yàn)，研究者認(rèn)為游離RPB3同樣招募ELL2，協(xié)助LEC復(fù)合物調(diào)控PolII全酶。另外研究者們在體外相分離實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Pol II CTD形成的液滴可招募游離RPB3在其液滴外表面。因此研究者提出：高水平的核糖體相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致Pol II轉(zhuǎn)錄工廠中的Pol II CTD捕獲游離RPB3，從而提高基因表達(dá)效率，提供了調(diào)控的特異性。

圖3. RPB3特異性調(diào)控核糖體蛋白基因3’末端加工的機(jī)制模型

總體而言，該工作揭示了RPB3以獨(dú)立于Pol II全酶，調(diào)控核糖體相關(guān)蛋白基因表達(dá)的新的模式，同時文章設(shè)計(jì)的SDDS系統(tǒng)對于研究其他多亞基復(fù)合物中具有非經(jīng)典兼職功能的亞基蛋白提供了新的策略。

圖4. 圖中代表雙子座（Gemini)。圖像中間是阿喀琉斯之盾，盾的中心是時間之神，邊緣是十二星座，代表12個亞基組成的RNA聚合酶II。第三個星座是雙子座, 正面對著我們的是哥哥（RPB3）。背對著我們的是弟弟（dRPB3），弟弟不常露面，被阿喀琉斯之盾（Pol II）困住（Trapping）

季雄是該論文的通訊作者。生命科學(xué)學(xué)院李圓君博士、黃捷博士，博士研究生包麗君、朱峻毅、段文嘉是該論文的共同第一作者。生命科學(xué)學(xué)院伊成器課題組、中國科學(xué)院生物物理所俞洋課題組為該工作提供了重要幫助。該工作得到北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、啟東創(chuàng)新基金、細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國家自然科學(xué)基金的資助。北京大學(xué)鳳凰工程多個儀器平臺對本項(xiàng)目提供了大力支持。

延伸閱讀：

季雄課題組長期從事RNA聚合酶亞基功能調(diào)控和疾病機(jī)理的研究。主要集中在RNA聚合酶相關(guān)的非經(jīng)典功能調(diào)控、疾病和分子探針等方向，近期成果發(fā)表在Cell、Molecular Cell（2）、Genome Biology（2）、Nature Communications、Cell Discovery、CMLS和iScience等雜志上，為選擇性基因表達(dá)調(diào)控提供新的假說。實(shí)驗(yàn)室因發(fā)展需要，招聘博士后2—3名。

論文作者從左至右：黃捷、朱峻毅、季雄、段文嘉、李圓君、包麗君

來源：北京大學(xué)