2023年4月6日，《Cell Stem Cell》期刊在線發(fā)表了題為《食蟹猴胚胎模型體外培養(yǎng)發(fā)育到原腸胚和引起早期妊娠反應(yīng)》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組、非人靈長類研究平臺孫強研究團(tuán)隊與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周帆研究組合作完成。該研究利用胚胎干細(xì)胞建立了食蟹猴類囊胚誘導(dǎo)系統(tǒng)，體外培養(yǎng)食蟹猴類囊胚可誘導(dǎo)原腸運動的相關(guān)胚層，體內(nèi)移植可以檢測到早期妊娠囊的出現(xiàn)。

胚胎著床至原腸運動是發(fā)育的關(guān)鍵時期，也是臨床上早期流產(chǎn)的高發(fā)期。相較于嚙齒類模式動物，靈長類著床至原腸運動時期的研究嚴(yán)重滯后?；谂咛ジ杉?xì)胞組裝的類胚胎研究為靈長類早期著床發(fā)育提供了新的途徑。目前小鼠胚胎干細(xì)胞來源的類胚胎能體外培養(yǎng)到神經(jīng)發(fā)生和器官發(fā)生階段，人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的類囊胚也可以模擬囊胚階段的形態(tài)和分子特征。

非人靈長類擁有與人更為相近的生殖發(fā)育和胚胎發(fā)育特點，是研究人類生殖和胚胎發(fā)育的理想動物模型。研究團(tuán)隊創(chuàng)新性地用非人靈長類胚胎干細(xì)胞代替人多能干細(xì)胞，進(jìn)行食蟹猴類囊胚體外誘導(dǎo)。研究人員通過比較不同培養(yǎng)狀態(tài)的食蟹猴胚胎干細(xì)胞以及優(yōu)化體外誘導(dǎo)體系和方法，高效得到了形態(tài)上和食蟹猴囊胚非常接近的類囊胚。結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序與分析、三個譜系干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，以及其他一系列分子細(xì)胞實驗證明食蟹猴類囊胚在主要細(xì)胞譜系組成以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組水平等和正常囊胚相似（圖1A-B）。為了研究其體外發(fā)育潛能，研究人員對食蟹猴類囊胚進(jìn)行了長時程體外延遲培養(yǎng)。

當(dāng)體外培養(yǎng)至D15，類囊胚發(fā)育至早期著床的雙層胚盤狀結(jié)構(gòu)，包括典型的OCT4+的EPI樣外胚層結(jié)構(gòu)和明顯的羊膜腔以及GATA6+的卵黃囊腔（圖1C）。研究人員進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)至D17，前面出現(xiàn)的雙層胚盤樣結(jié)構(gòu)的食蟹猴類胚胎中會有一小部分繼續(xù)發(fā)育，形成圓盤樣結(jié)構(gòu)，并包含前后軸、原條，絨毛膜腔等特征性細(xì)胞群體，且部分形態(tài)與之前報道的人類CS7（E16-19）時期的體內(nèi)原腸胚相似（圖1D）。免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步展示了其形態(tài)特征（圖1E）。結(jié)合測序數(shù)據(jù)的挖掘和對比分析，作者發(fā)現(xiàn)D17食蟹猴類胚胎具有上胚層細(xì)胞（EPI）, 原條細(xì)胞（gastrulating cells）, 原始生殖細(xì)胞（PGCs）, 羊膜上皮細(xì)胞（AME）, 胚外中胚層細(xì)胞（EXMC）, 滋養(yǎng)層細(xì)胞（TE）, 內(nèi)臟內(nèi)胚層/卵黃囊內(nèi)胚層細(xì)胞（VE/YE）等。此外，D17食蟹猴類胚胎中還檢測到了原始造血相關(guān)細(xì)胞，包括造血內(nèi)皮細(xì)胞 (HECs), 造血內(nèi)皮祖細(xì)胞 (HEPs)以及幼紅細(xì)胞(Ery)。這意味著D17食蟹猴類胚胎已經(jīng)進(jìn)入三胚層分化階段。

研究團(tuán)隊進(jìn)一步分析鑒定發(fā)現(xiàn)D17食蟹猴類胚胎還具有胚胎非神經(jīng)外胚層（NNE）、新生中胚層（NM），晚期中胚層（AM）、定型內(nèi)胚層（DE）等三胚層類似的細(xì)胞群體（圖1F）。該研究揭示了D17食蟹猴類胚胎無論從形態(tài)還是細(xì)胞譜系組成上都與之前報道的人的CS7（E16-19）時期的體內(nèi)原腸胚相似，提示誘導(dǎo)的類囊胚具有模擬著床后發(fā)育的能力。研究團(tuán)隊將該發(fā)育潛能的食蟹猴類囊胚進(jìn)行同種體內(nèi)移植，進(jìn)一步檢測其體內(nèi)發(fā)育潛力。結(jié)果顯示，3/8受體在移植后能檢測到明顯的著床點和早期妊娠囊的出現(xiàn)，同時伴隨血清中絨毛膜促性腺激素和孕激素水平的提高（圖2）。

該研究利用胚胎干細(xì)胞體外重構(gòu)了非人靈長類類囊胚，并對其體內(nèi)外發(fā)育潛能進(jìn)行深入全面的探究和評估，首次將非人靈長類的類囊胚體外培養(yǎng)至著床后原腸胚時期。

中科院腦智卓越中心博士后李杰，清華大學(xué)周帆課題組科研助理朱慶元，中科院腦智卓越中心與西北農(nóng)林科技大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士生曹靜，清華大學(xué)2021級博士生劉瑩、中科院腦智卓越中心非人靈長類研究平臺實驗師陸勇為該論文共同第一作者。中科院腦智卓越中心孫怡迪研究員、孫怡寧、黃奕銘、尚申申、卞新顏、李春楊、張連升博士、王燕、聶艷紅、傅吉強博士，清華大學(xué)2021級博士生李倩，中科院廣州健康院Miguel A. Esteban研究員、李文娟博士、Md. Abdul Mazid博士、姜禹、賈雯淇，西北農(nóng)林科技大學(xué)王曉龍研究員為本研究提供了重要幫助。該研究得到科技部、中科院、上海市、基金委和臨港實驗室的資助。

圖1.（A）非人靈長類食蟹猴類囊胚體外重構(gòu)。（B）scRNA-seq分析體外重構(gòu)的非人靈長類食蟹猴類囊胚的細(xì)胞譜系構(gòu)成。（C）非人靈長類食蟹猴類囊胚體外延遲培養(yǎng)至D15時形成的雙層胚盤樣結(jié)構(gòu)。（D）非人靈長類食蟹猴類囊胚體外延遲培養(yǎng)至D17時形成的原腸胚樣結(jié)構(gòu)。（E）非人靈長類食蟹猴D17類胚胎的形態(tài)學(xué)染色。OCT4, EPI marker. GATA6, amine marker. T(Brachyury), gastrulation marker. （F）非人靈長類食蟹猴D17類胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析和發(fā)育路徑分析。

圖2.?非人靈長類類囊胚體外重構(gòu)和體內(nèi)外發(fā)育潛能研究模式圖。

來源：中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心