胃癌是一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，具有強(qiáng)烈的腫瘤異質(zhì)性，在臨床上常表現(xiàn)為多樣的組織病理學(xué)類型。例如，按照最新的WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類，胃癌包括管狀腺癌、乳頭狀腺癌、低粘附癌、印戒細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌以及肝樣胃癌等多種病理類型。其中混合型胃癌是高度腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性的典型代表，同一個腫瘤中至少含有兩種以上病理成分，且更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。然而，目前基于組織病理學(xué)的胃癌分型在指導(dǎo)臨床治療中發(fā)揮的作用仍然有限，關(guān)鍵原因是目前對胃癌不同病理亞型的分子特征認(rèn)知不足，這是亟待進(jìn)一步探究的方向。

4月12日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心湯富酬教授課題組與合作者在National Science Review期刊發(fā)表了題為“Integrative single-cell multiomics analyses dissect molecular signatures of intratumoral heterogeneities and differentiation states of human gastric cancer”的研究論文。

論文截圖

在該研究中，研究人員利用胃癌根治性手術(shù)切除標(biāo)本，收集配對的癌旁、原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶并對每個腫瘤部位進(jìn)行多點(diǎn)采樣，對來自14例胃癌患者的85個樣品進(jìn)行了優(yōu)化的單細(xì)胞多組學(xué)【基因組（拷貝數(shù)變異）、DNA甲基化組、染色質(zhì)狀態(tài)組、以及轉(zhuǎn)錄組】測序（scTrio-seq3），并結(jié)合同一采樣位點(diǎn)的組織病理學(xué)分型結(jié)果進(jìn)行了系統(tǒng)、深入的數(shù)據(jù)整合分析，精準(zhǔn)繪制了胃癌的單細(xì)胞DNA甲基化圖譜，揭示了混合型胃癌不同分化狀態(tài)癌細(xì)胞的多個組學(xué)層面的關(guān)鍵分子特征以及免疫微環(huán)境特征，有望為胃癌的臨床診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計

該研究的主要發(fā)現(xiàn)如下：

1、揭示了不同胃癌患者癌細(xì)胞基因表達(dá)異常的共性規(guī)律

該研究篩選出334個在14例胃癌患者的癌細(xì)胞中普遍上調(diào)的基因以及82個普遍下調(diào)的基因。通過與癌旁正常胃上皮細(xì)胞以及結(jié)直腸癌癌旁正常腸上皮細(xì)胞的系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)胃癌異常上調(diào)基因中有26個是腸上皮細(xì)胞特異高表達(dá)的基因，例如TFF3、CLDN3、CLDN4、CLDN7、TMEM176A、TMEM176B和MUC13等。這不僅發(fā)生在腸型胃癌中，也發(fā)生在彌漫型以及混合型胃癌中。同時，一些正常胃上皮細(xì)胞特異性表達(dá)并參與行使胃正常生理功能的基因在胃癌細(xì)胞中普遍顯著下調(diào)，例如PGA3、PGA5、PGC、LIPF、GKN1、GKN2、MUC1、MUC5AC和MUC6等。這說明胃癌的腫瘤發(fā)生過程中上皮細(xì)胞發(fā)生去分化，失去部分正常胃上皮的基因表達(dá)特征和正常生理功能。同時，由于這些癌細(xì)胞的可塑性增加，因而異常表達(dá)了數(shù)十個腸上皮高表達(dá)基因。因?yàn)樵谡０l(fā)育過程中，胃上皮和腸上皮來自共同的消化道上皮前體細(xì)胞，胃癌細(xì)胞異常表達(dá)部分腸上皮特異性基因說明胃癌細(xì)胞失去部分分化特征的同時獲得了很強(qiáng)的可塑性，這對理解胃癌易復(fù)發(fā)、易耐藥的特征提供了新的研究視角。

26個正常結(jié)腸上皮高表達(dá)并在胃癌細(xì)胞中上調(diào)的基因。NAT，胃癌癌旁正常上皮細(xì)胞

通過聯(lián)合單細(xì)胞表觀組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)可及性和DNA甲基化水平的異常改變可能解釋部分基因在胃癌細(xì)胞中表達(dá)量的異常改變，為理解胃癌發(fā)生過程中基因表達(dá)異常的表觀遺傳學(xué)調(diào)控提供了重要線索。

代表性基因的表達(dá)水平與啟動子DNA甲基化和啟動子染色質(zhì)可及性

2、系統(tǒng)繪制了胃癌的單細(xì)胞DNA甲基化圖譜

多個胃癌患者共有的胃癌細(xì)胞中異常甲基化的基因（啟動子區(qū)域）

該研究系統(tǒng)繪制了胃癌單細(xì)胞DNA甲基化圖譜，確認(rèn)了胃癌在腫瘤發(fā)生過程中癌細(xì)胞經(jīng)歷了全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化，特別是在重復(fù)元件LINE、SINE、LTR和Satellite等基因組區(qū)域DNA去甲基化幅度更大，并且在不同患者間和同一患者內(nèi)均具有強(qiáng)烈異質(zhì)性。相比于結(jié)直腸癌，胃癌的基因組去甲基化幅度更大。其中，胃癌細(xì)胞基因組中LINE-1的DNA甲基化水平強(qiáng)烈下降，同時LINE-1編碼的ORF1p蛋白異常上調(diào)表達(dá)，提示部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1很可能在胃癌細(xì)胞中被異常激活轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座，進(jìn)而破壞基因組完整性。

該研究鑒定了多個患者共有的胃癌細(xì)胞特異高甲基化或特異性低甲基化的基因（啟動子區(qū)域），這些基因可作為候選的胃癌DNA甲基化標(biāo)志物，例如異常高甲基化的TMEM240和HAGLROS基因的啟動子區(qū)域，以及異常低甲基化的TRPM2-AS和HRH1基因的啟動子區(qū)域。這一發(fā)現(xiàn)有望為胃癌的臨床診斷提供理論依據(jù)。

3、揭示了混合型胃癌癌細(xì)胞遺傳克隆、DNA甲基化亞群以及轉(zhuǎn)錄組亞群之間的復(fù)雜交互關(guān)系

鑒于混合型胃癌的腫瘤異質(zhì)性極強(qiáng)，該研究采取多點(diǎn)取樣以及單細(xì)胞多組學(xué)測序方案，為探究混合型胃癌癌細(xì)胞的空間位置、遺傳克隆、DNA甲基化亞群以及基因表達(dá)亞的交互關(guān)系提供了堅實(shí)基礎(chǔ)。首先，通過染色體拷貝數(shù)變異模式準(zhǔn)確鑒定同一個患者體內(nèi)的癌細(xì)胞的遺傳譜系，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化亞群與遺傳克隆高度吻合，在同一個患者體內(nèi)同一個遺傳克隆內(nèi)的不同癌細(xì)胞的DNA甲基化水平相似，而不同遺傳克隆癌細(xì)胞的DNA甲基化水平常常差異很大。這說明全基因組去甲基化在胃癌遺傳克隆形成的時候已經(jīng)基本確立，而在后續(xù)的克隆擴(kuò)張過程中可維持相對穩(wěn)定。

DNA甲基化的層次聚類分群與遺傳克隆一致

然而，同一個胃癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的遺傳克隆或者DNA甲基化亞群與轉(zhuǎn)錄組亞群之間并非簡單的一一對應(yīng)關(guān)系，同一個遺傳克隆的癌細(xì)胞可以對應(yīng)多個轉(zhuǎn)錄組亞群，不同遺傳克隆的癌細(xì)胞也可以對應(yīng)同一個轉(zhuǎn)錄組亞群。此外，混合型胃癌呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的空間異質(zhì)性，不僅同一患者不同取樣位置包含的癌細(xì)胞遺傳克隆、DNA甲基化亞群和轉(zhuǎn)錄組亞群可以存在差異，同一取樣位置內(nèi)部也可以含有多個不同的遺傳克隆、DNA甲基化亞群或轉(zhuǎn)錄組亞群。

遺傳譜系、轉(zhuǎn)錄組亞群和取樣位置的對應(yīng)情況

4、聯(lián)合單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)分析、多點(diǎn)取樣及點(diǎn)對點(diǎn)組織病理學(xué)分析精準(zhǔn)鑒定混合型胃癌不同分化狀態(tài)癌細(xì)胞的多個組學(xué)層面的關(guān)鍵分子特征及免疫微環(huán)境特點(diǎn)

該研究通過分析不同胃癌轉(zhuǎn)錄組亞群的特征基因，鑒定出每個轉(zhuǎn)錄組亞群癌細(xì)胞的分化狀態(tài)，包括腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌，并且與同一采樣位點(diǎn)的病理分析結(jié)果基本吻合。此外，將腺癌進(jìn)一步細(xì)分為不同的分化程度（高分化、中分化和低分化）是一件頗具挑戰(zhàn)性的工作，主要原因包括：（1）由于胃癌患者間異質(zhì)性強(qiáng)烈，目前仍缺乏已知、通用的可用于鑒定腺癌內(nèi)部不同分化程度腫瘤的標(biāo)志基因；(2) 盡管每個取樣部位的病理分析結(jié)果可以提供有力證據(jù)，但同一個取樣部位內(nèi)部依然可能存在空間異質(zhì)性。針對這一問題，該研究充分發(fā)揮多點(diǎn)取樣、同一采樣位點(diǎn)病理分析及單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)分析的聯(lián)合優(yōu)勢，在UMAP分群受患者間異質(zhì)性影響較大的情況下，采用PCA的PC3軸將每個混合型胃癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的不同分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄組亞群區(qū)分開，包括區(qū)分腺癌內(nèi)部不同的分化程度（高分化、中分化和低分化），并與同一采樣位點(diǎn)的病理分析結(jié)果基本吻合。

對混合型胃癌患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的PCA降維結(jié)果

在準(zhǔn)確鑒定癌細(xì)胞不同分化狀態(tài)的基礎(chǔ)上，該研究進(jìn)一步探究了不同分化狀態(tài)癌細(xì)胞的分子特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粘蛋白家族成員MUC1在中分化和高分化腺癌中高表達(dá)，在每個患者體內(nèi)隨著分化狀態(tài)變差其表達(dá)量顯著降低。纖連蛋白FN1在分化狀態(tài)較差（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）的癌細(xì)胞中表達(dá)量顯著升高。并且，基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)可及性和DNA甲基化的改變可以部分解釋部分基因在不同分化狀態(tài)間表達(dá)水平的差異。此外，盡管胃癌分化狀態(tài)的特征基因在患者間表現(xiàn)出強(qiáng)烈異質(zhì)性，卻可以匯聚到一些共性的信號通路上。例如，每個患者體內(nèi)分化狀態(tài)較差的癌細(xì)胞上調(diào)的基因富集在細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)通路，而每個患者體內(nèi)分化狀態(tài)較好的癌細(xì)胞上調(diào)的基因富集在免疫相關(guān)通路。

MUC1和FN1蛋白的免疫組化結(jié)果。ADC，腺癌；NEC，神經(jīng)內(nèi)分泌癌；HAS，肝樣胃癌

該研究發(fā)現(xiàn)，對于多數(shù)混合型胃癌患者（5/6）的原發(fā)灶癌細(xì)胞，分化狀態(tài)較差的癌細(xì)胞的全基因組DNA甲基化水平顯著高于分化狀態(tài)較好的癌細(xì)胞，但仍低于正常胃上皮細(xì)胞。該結(jié)果提示胃癌在腫瘤發(fā)生早期發(fā)生的大規(guī)模全基因組去甲基化使得以LINE-1為代表的重復(fù)序列被異常轉(zhuǎn)錄，激活了胃癌細(xì)胞作為上皮細(xì)胞的抗原遞呈特性，使得免疫細(xì)胞可以識別這些癌細(xì)胞。而在這些癌細(xì)胞進(jìn)一步去分化或者轉(zhuǎn)分化（變成神經(jīng)內(nèi)分泌癌或者肝樣胃癌）過程中其全基因組甲基化水平部分回調(diào)，可能部分抑制了重復(fù)序列的異常轉(zhuǎn)錄，降低了癌細(xì)胞的抗原遞呈特性，從而使得免疫細(xì)胞更難識別和攻擊這些低分化或者轉(zhuǎn)分化的癌細(xì)胞。

每個胃癌患者體內(nèi)不同分化狀態(tài)的原發(fā)灶癌細(xì)胞的全基因組DNA甲基化水平

通過在同時含有腺癌和非腺癌的混合型胃癌內(nèi)部進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)非腺癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）內(nèi)部的CD8⁺T細(xì)胞浸潤水平較低，CD8⁺T細(xì)胞主要存在于腫瘤邊緣，呈現(xiàn)出免疫排斥型的免疫微環(huán)境特征。相反，腺癌內(nèi)部的CD8⁺T細(xì)胞浸潤水平相對較高。相應(yīng)地，腺癌部分的免疫相關(guān)通路評分也顯著高于非腺癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）部分。

一例代表性的混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的CD8免疫組化結(jié)果

總之，該研究通過對胃癌根治手術(shù)標(biāo)本中配對的癌旁、原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行系統(tǒng)性多點(diǎn)采樣和單細(xì)胞多組學(xué)（基因組、DNA甲基化組、染色質(zhì)狀態(tài)組以及轉(zhuǎn)錄組）測序分析，揭示了不同胃癌患者癌細(xì)胞基因表達(dá)異常的共性規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同分型的胃癌都普遍高表達(dá)腸上皮細(xì)胞特異性基因，這反映了胃癌細(xì)胞在失去正常生理功能的去分化過程中其可塑性也普遍增加。系統(tǒng)繪制了胃癌的單細(xì)胞DNA甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)胃癌與結(jié)直腸癌類似，在腫瘤發(fā)生過程中其癌細(xì)胞經(jīng)歷了全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化，同時少量基因的啟動子區(qū)域發(fā)生DNA甲基化異常上調(diào)；發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌類似，在同一胃癌中同一個遺傳克隆內(nèi)的不同癌細(xì)胞的DNA甲基化水平相似，而不同遺傳克隆癌細(xì)胞的DNA甲基化水平常常差異很大。這說明全基因組DNA去甲基化在胃癌腫瘤發(fā)生相對早期的階段就完成了，并在此后每個遺傳克隆的擴(kuò)張過程中基本維持不變。發(fā)現(xiàn)同一胃癌中癌細(xì)胞的遺傳克隆或者DNA甲基化亞群與轉(zhuǎn)錄組亞群之間并非簡單的一一對應(yīng)關(guān)系，同一個遺傳克隆的癌細(xì)胞可以對應(yīng)多個轉(zhuǎn)錄組亞群，不同遺傳克隆的癌細(xì)胞也可以對應(yīng)同一個轉(zhuǎn)錄組亞群；發(fā)現(xiàn)在混合型胃癌中，相比于分化狀態(tài)較好的癌細(xì)胞，分化狀態(tài)較差（例如神經(jīng)內(nèi)分泌癌、肝樣胃癌）的癌細(xì)胞部分回調(diào)全基因組甲基化，上調(diào)細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)通路基因，下調(diào)免疫相關(guān)通路基因，免疫浸潤水平較低。

北京大學(xué)卞舒惠博士（現(xiàn)為南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授）、王藝橙博士、周圓博士為本文共同第一作者，湯富酬和北京大學(xué)第三醫(yī)院周鑫副研究員為本文的共同通訊作者。該研究工作得到國家自然科學(xué)基金委員會、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心等經(jīng)費(fèi)資助。

來源： 生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心