經(jīng)典的細(xì)胞骨架是由微管（microtubule）、微絲（F-actin）或者中間絲組成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞的穩(wěn)定性維持、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞運(yùn)動方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。除此之外，動物細(xì)胞中還存在一種以血影蛋白spectrin為基礎(chǔ)的二維網(wǎng)狀形式的膜骨架系統(tǒng)。膜骨架平行于細(xì)胞膜分布，緊貼在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，賦予細(xì)胞膜更高的機(jī)械強(qiáng)度和可塑性(Lux, 2016)（圖1）。膜骨架與細(xì)胞膜的功能活動密切關(guān)聯(lián)：通過與膜蛋白的互作，膜骨架可以調(diào)控膜蛋白在細(xì)胞膜上的定位，促進(jìn)膜蛋白聚簇形成高級組織形式，同時也參與調(diào)控細(xì)胞對外界信號的響應(yīng)。上世紀(jì)60年代，膜骨架首先在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，針對膜骨架的分子層面的研究也多以紅細(xì)胞為模型。隨后在神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的細(xì)胞膜上也證實了膜骨架的存在及其功能的重要性。膜骨架在神經(jīng)細(xì)胞中的組織形式和功能也有較多研究，在軸突起始段（axon initial segments）和郎氏結(jié)（nodes of Ranvier）的形成上起著關(guān)鍵作用。

圖1 紅細(xì)胞膜骨架示意圖

紅細(xì)胞的膜骨架整體上呈現(xiàn)六邊形為主的多邊形二維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，而在軸突細(xì)胞膜上，膜骨架沿著軸突以一維周期性網(wǎng)格（quasi-1D periodic lattice）的形式排布。這些網(wǎng)格以一種特異的短的F-actin為網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)，以spectrin四聚體為網(wǎng)格線；每一個節(jié)點(diǎn)上，F(xiàn)-actin作為集線器連結(jié)多條spectrin纖維，將其匯聚到一起（圖1）。多種F-actin結(jié)合蛋白進(jìn)一步穩(wěn)定這種連結(jié)并調(diào)控其功能，包括不同F(xiàn)-actin所通用的原肌球蛋白（tropomyosin）和原肌球調(diào)節(jié)蛋白（Tropomodulin，Tmod)，以及膜骨架特異的adducin、protein 4.1（P4.1）和dematin等。這種由actin、spectrin及輔助因子組成的網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)稱為spectrin-actin junctional complex，是膜骨架的核心復(fù)合物。膜骨架主要通過兩個位點(diǎn)與膜蛋白建立連接（Lux, 2016； Mankelow et al., 2012）：一是junctional complex通過P4.1、adducin、dematin與膜蛋白互作；二是在spectrin纖維的中段，由另一種蛋白因子ankyrin與多種膜蛋白形成ankyrin complex（Bruce et al., 2003；Vallese et al., 2022；Xia et al., 2022）。

基于膜骨架在細(xì)胞膜的機(jī)械強(qiáng)度和代謝活動中的關(guān)鍵角色，其功能的紊亂與多種人類疾病密切相關(guān)(An and Mohandas, 2008；Bennett and Healy, 2008)。Spectrin、ankyrin、P4.1等膜骨架組成因子的缺失或突變導(dǎo)致多種遺傳性紅細(xì)胞異常疾病的發(fā)生；Ankyrin-B功能缺失的突變與一種遺傳性心律失常疾病直接相關(guān)，稱為ankyrin-B綜合征；Adducin的多種位點(diǎn)突變與高血壓具有高度的關(guān)聯(lián)性；此外，β-III-spectrin會導(dǎo)致一種遺傳性的神經(jīng)退行性疾病，spinocerebellar ataxia type 5。關(guān)于膜骨架核心復(fù)合物junctional complex的成分組成的研究工作較多，但是這些因子的精確的分子角色和功能機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，同時也尚不能排除該復(fù)合物是否含有更多未知的組成因子。目前領(lǐng)域內(nèi)對junctional complex的結(jié)構(gòu)研究相對滯后，缺乏高分辨的結(jié)構(gòu)信息，這很大程度上限制了對其組成因子功能角色的深入理解。

論文截圖

2023年4月11日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、生命科學(xué)聯(lián)合中心高寧/李寧寧課題組在Cell期刊在線發(fā)表了題為“Structural basis of membrane skeleton organization in red blood cells”的研究論文。經(jīng)過大量的條件優(yōu)化，課題組成功從豬血紅細(xì)胞中分離出了膜脂被完全清除、在冷凍電鏡條件下具有較好分散度的膜骨架網(wǎng)格（圖2），并對這一完整的內(nèi)源膜骨架系統(tǒng)進(jìn)行了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析，最終獲得了junctional complex的高分辨結(jié)構(gòu)，揭示了junctional complex和膜骨架組裝的分子細(xì)節(jié)，闡釋了其組成因子在膜骨架組裝和穩(wěn)定性維持方面的分子機(jī)制。

圖2 豬紅細(xì)胞的膜骨架冷凍電鏡原始成像圖片（紅色方框內(nèi)為由多條spectrin纖維連接起來的兩個臨近的junctional complex）

從高分辨的三維結(jié)構(gòu)中可以清楚地理解junctional complex的組織形式（圖3）。junctional complex全長約42nm，核心部分是由12個actin亞基組成的6層的F-actin。在第1層到第5層（圖3中，從上到下）之間總共固定有8根spectrin纖維。調(diào)控F-actin長度的Tmod單體和adducin四聚體分別扣在F-actin的兩端（pointedend和barbedend），阻止F-actin的延長或解聚。此外兩條tropomyosincoiledcoil（TMCC）分別結(jié)合在F-actin的兩側(cè)，與Tmod和adducin也分別都有互相作用，三者共同決定了junctional complex的長度。在第2層到第5層之間，三個dematin分子以延展的結(jié)構(gòu)環(huán)繞junctional complex的主干部分，與多個actin和spectrin亞基互作。從整體上來看，junctional complex的組成因子都分別與內(nèi)部的多個亞基互作，構(gòu)成了一個錯綜復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，共同維持了spectrin-actin連結(jié)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。關(guān)于junctional complex各個組分包括actin、spectrin、adducin的分子比例，此前也是領(lǐng)域爭論的一個焦點(diǎn)，這項工作的結(jié)構(gòu)部分也明確了各個組成因子在復(fù)合物中的化學(xué)計量比以及寡聚形式。

圖3 Spectrin-actin junctional complex冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

除此之外，這項工作還有多個重要的新發(fā)現(xiàn)：（1）從結(jié)構(gòu)中鑒定了junctional complex的一個新的組成因子SH3BGRL2，同Tmod共同組成了一個完整的帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合在F-actin的pointedend，以維持F-actin的穩(wěn)定性。該工作通過體內(nèi)pull-down實驗進(jìn)一步驗證了HEK293細(xì)胞的Tmod-F-actin復(fù)合物中也存在SH3BGRL2。結(jié)合已有的SH3BGRL2的研究數(shù)據(jù)，該工作的研究表明SH3BGRL2可能是F-actin系統(tǒng)通用的pointedend結(jié)合蛋白。（2）adducin作為一種F-actin的帽子蛋白，其四聚體的主體部分結(jié)合在F-actin的barbedend以維持復(fù)合物的穩(wěn)定。但與此同時，adducin的N末端和C末端伸出四個類似觸手的柔性序列分別結(jié)合在F-actin 的第5層和第6層上，與actin及spectrin互作。這一結(jié)構(gòu)信息一方面解釋了此前研究中發(fā)現(xiàn)的adducin促進(jìn)spectrin和actin結(jié)合的功能，另一方面adducin的觸手占據(jù)了第5層和第6層上的spectrin和dematin結(jié)合位點(diǎn)，從而構(gòu)成了決定junctional complex上spectrin和dematin分子數(shù)量的一個關(guān)鍵因素。（3）在以往所有的F-actin結(jié)構(gòu)中，tropomyosin主要通過與actin直接互作的方式對稱地結(jié)合在F-actin兩側(cè)。但在junctional complex中，tropomyosin主要通過與spectrin、dematin、adducin互作間接地結(jié)合在F-actin纖維上，表明該工作發(fā)現(xiàn)了一種新的tropomyosin與F-actin的結(jié)合模式（圖4）。

圖4 Junctional complex中TMCC與F-actin間接結(jié)合

進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，junctional complex的組成元件存在多種層面的功能冗余性。（1）紅細(xì)胞膜骨架主要呈六邊形網(wǎng)格，但junctional complex卻含有8條spectrin纖維，即每個網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)可以發(fā)出8條可用的網(wǎng)格線；（2）adducin四聚體共含有8條可結(jié)合actin的類似觸手的柔性序列，但復(fù)合物中僅需要四條柔性序列的結(jié)合；（3）junctional complex的tropomyosin含有兩種亞型，可以同二聚體或異二聚體的形式組成TMCC，降低了一種亞型異常對復(fù)合物穩(wěn)定性帶來的影響；（4）Dematin是穩(wěn)定junctional complex的關(guān)鍵因子，復(fù)合物中結(jié)合有三個dematin分子，但卻含有7個dematin的C端headpiece結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)，有利于dematin的快速結(jié)合。這種多層次的冗余性可能是一種故障保險機(jī)制，保證了膜骨架組裝的魯棒性，并為膜骨架的變形提供了支持。

綜上，該工作解析了紅細(xì)胞膜骨架的核心復(fù)合物spectrin-actin junctional complex的高分辨結(jié)構(gòu)，為理解膜骨架的組裝和動態(tài)性以及其組成元件在膜骨架穩(wěn)定和調(diào)控中的分子機(jī)制提供了一個結(jié)構(gòu)框架。多個junctional complex的組成因子都屬于通用性的F-actin結(jié)合蛋白，因此該工作的研究結(jié)果也為其它的F-actin系統(tǒng)提供了重要的結(jié)構(gòu)和機(jī)制信息。此外，值得一提的是，膜骨架的樣品極度不均一（圖2），對顆粒挑選和高分辨結(jié)構(gòu)計算都有很大的干擾，該工作的數(shù)據(jù)處理流程也為“半純化的”（semi-purified）的復(fù)雜生物樣品的結(jié)構(gòu)研究提供了一種新思路。

高寧和李寧寧為本文的共同通訊作者，李寧寧和前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生陳思伊（昌平實驗室研究生項目）為本文的共同第一作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張強(qiáng)鋒教授和課題組博士后徐魁、北京生命科學(xué)研究所董夢秋研究員和課題組博士生何夢婷也參與了這項工作。該研究得到了膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、昌平實驗室、國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、啟東-SLS創(chuàng)新基金的支持。北京大學(xué)電鏡實驗室、冷凍電鏡平臺、高性能計算平臺、生命科學(xué)學(xué)院儀器中心及國家蛋白質(zhì)基礎(chǔ)設(shè)施（北大分平臺）對本項目提供了重要的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

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Bruce, L.J., Beckmann, R., Ribeiro, M.L., Peters, L.L., Chasis, J.A., Delaunay, J., Mohandas, N., Anstee, D.J., and Tanner, M.J. (2003). A band 3-based macrocomplex of integral and peripheral proteins in the RBC membrane. Blood 101, 4180-4188.

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Xia, X., Liu, S., and Zhou, Z.H. (2022). Structure, dynamics and assembly of the ankyrin complex on human red blood cell membrane. Nat Struct Mol Biol 29, 698-705.

來源：北京大學(xué)