CRISPR技術(shù)改變了我們操縱基因組進行研究和基因治療的能力，使用帶有同源臂的外源供體作為模板依賴同源介導修復（HDR）途徑來精確敲入基因。然而，對于基因大小的DNA供體模板，HDR途徑較為低效。目前，可采用在ssDNA或dsDNA供體末端引入化學修飾以增強供體穩(wěn)定性，供體共價連接到CRISPR系統(tǒng)上提高切割位點局部濃度等方法提高基因敲入效率。然而，這些方法具有操作困難、成本高等問題。亟需進一步優(yōu)化基因敲入的供體，以促進CRISPR/Cas9介導的基因大小的敲入在生命科學和臨床治療中的應(yīng)用。

鑒于此，梁好均課題組深入調(diào)研ssDNA和dsDNA作為供體的敲入機理，結(jié)合課題組在核酸化學領(lǐng)域的經(jīng)驗，在單個供體中整合ssDNA和dsDNA的獨特優(yōu)勢，設(shè)計并提出了一種具有3′懸突的dsDNA結(jié)構(gòu)（odsDNA），并將其作為供體實現(xiàn)CRISPR/Cas9介導的大片段基因敲入（LOCK）。

本工作是梁好均課題組繼dsDNA供體5′末端化學修飾提高基因敲入效率和RNA介導的CRISPR-dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)之后，在基因編輯方向的又一重大突破。該研究提出了一種經(jīng)濟普適的方法來制備任意3′懸突長度的odsDNA供體，利用鏈中帶有連續(xù)五個硫代磷酸酯（phosphorothioate）修飾的引物通過PCR擴增目的基因序列，再通過Lambda核酸外切酶消化處理，得到具有3′懸突的odsDNA。研究通過比較基因大?。?.1kb和2.5kb）的DNA供體的敲入效率，發(fā)現(xiàn)odsDNA顯著提高了靶向精確敲入效率，且與通用的dsDNA供體相比最高可提高4.3倍，同時在許多哺乳動物細胞跨多個基因組位點中保持了較低的插入缺失率和脫靶事件。當利用3′單鏈懸臂與偶聯(lián)技術(shù)結(jié)合時，使用odsDNA供體的敲入效率比dsDNA供體提高5.2倍。該LOCK策略在基因敲入中具有優(yōu)勢，有望在未來取代ssDNA或dsDNA供體，實現(xiàn)其他策略無法完成的大片段基因敲入。

研究工作得到科學技術(shù)部和國家自然科學基金的支持。

論文鏈接

圖1.（A）ssDNA供體基因敲入的機理，（B）dsDNA供體基因敲入的機理，（C）odsDNA的結(jié)構(gòu)，（D）odsDNA供體基因敲入的機理

圖2.odsDNA的合成示意圖及用于基因敲入的三種方法

來源： 中國科學技術(shù)大學