CRISPR-Cas技術促進生物醫(yī)學研究。除了廣泛使用的Cas9系統之外，其他CRISPR亞型也不斷被發(fā)現并應用于基因編輯，例如能夠裝載進AAV病毒的SaCas9（1053 aa）以及更小的微型CRISPR-Cas系統Cas12f（400~550 aa）。已發(fā)表的工作重建了CRISPR-Cas系統的起源，發(fā)現了原核轉座子編碼的IscB和TnpB蛋白分別是Cas9與Cas12核酸酶的祖先。這些祖先蛋白尺寸較小，但是否具備核酸酶活性缺乏證據；直到2021年，IscB和TnpB被發(fā)現在非編碼RNA（omegaRNA或reRNA）引導下切割雙鏈DNA，證實了其與CRISPR-Cas系統相似的工作機制。TnpB由IS200/IS605等原核轉座子家族編碼，并被推測參與轉座子的擴張。TnpB的分布非常廣泛，在目前已知的基因組存在超過百萬的拷貝；而此前研究只發(fā)現了一種在人類細胞中具有活性的TnpB核酸酶（ISDra2），且效率不高；因此，TnpB這一有潛力作為微型編輯工具的多樣性寶庫急需系統性的挖掘和研究。同時，由于可能推動轉座子擴張，TnpB靶向切割DNA所依賴的關鍵元件（如reRNA）與轉座子或存在關聯，因而可以基于轉座子信息進行預測，這將為工具的開發(fā)提供便利。

6月29日，中國科學院動物研究所/北京干細胞與再生醫(yī)學研究院研究員王皓毅、博士項光海和動物所研究員張勇團隊合作，在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）上，在線發(fā)表了題為Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors的研究論文?！蹲匀?生物技術》同時發(fā)表了Research Briefing文章，對該成果進行總結和展望（Hypercompact genome editors are discovered by mining a transposon family）。該研究創(chuàng)新性地建立了對TnpB相關靶向基因編輯系統的大規(guī)模挖掘方法，并首次對多樣性極其豐富的TnpB核酸酶進行了大規(guī)模挖掘，從而鑒定到33個在原核系統具有靶向編輯活性的TnpB蛋白，其中5個在真核系統具有活性。

研究對ISfinder原核轉座子數據庫中IS605編碼的TnpB蛋白進行了全面的分析和挖掘，從64個候選項中鑒定出25種在大腸桿菌中活躍的系統，其中3種在人類細胞中具有基因編輯活性。該工作對功能數據的進一步分析揭示了TnpB蛋白相關的reRNA骨架與IS200/IS605轉座子的RE序列具有完全重疊的3’末端，而TAM序列則與轉座子上游的插入位點序列相同。研究表明，在TnpB系統中，與RNA介導的編輯器相關的三大要素（核酸酶、gRNA骨架和TAM序列）均可通過生物信息分析準確預測，這為大規(guī)模篩選高活性TnpB核酸酶奠定了基礎。這一發(fā)現同時進一步確定了TnpB在IS605中的功能，即作為歸巢核酸酶切割轉座之后的原位點，從而誘導重組修復實現轉座子的拷貝數擴增。

進一步，該團隊從4個方面對TnpB相關的reRNA骨架進行了分析。結果表明：reRNA骨架在120-300nt的長度范圍內均能夠有效發(fā)揮功能，而120-140nt的reRNA骨架活性最強；reRNA骨架在3’末端的堿基對其功能有重要影響，單一堿基的突變即會顯著降低編輯活性；靶向序列的長度在16-20nt為最佳；靠近TAM端的12nt是TnpB編輯器的核心序列。研究進一步整合分析了影響TnpB編輯器活性的潛在因素，發(fā)現了來自細菌的、由多拷貝轉座子編碼的、具有完整蛋白結構域和保守氨基酸的TnpB編輯器更為活躍。

該團隊基于上述研究，建立了大規(guī)模挖掘全新TnpB基因編輯器的方法（如圖），對部分未經轉座子注釋的原核基因組進行了從頭注釋和功能預測，并直接在人類細胞系中篩選獲得了新的微型高活性TnpB編輯器ISAam1（369 aa）和ISYmu1（382 aa）。與其他微型Cas蛋白的平行比較發(fā)現，ISAam1和ISYmu1的活性與SaCas9相當，顯著高于數種已報道的Cas12f蛋白及其變體。

綜上，該研究建立了適用于TnpB編輯器的大規(guī)模篩選體系，進一步證明了TnpB在轉座子擴張中的功能，并對這一類編輯器進行了系統的功能解析，從而獲得了目前最小的具備原創(chuàng)知識產權的微型基因編輯器。考慮到體內基因治療和細胞治療經常因Cas蛋白過大而遞送受限，這一成果將推動相關方面的研究和臨床應用。

王皓毅致力于新型基因編輯工具的開發(fā)及CAR-T細胞治療研究；張勇致力于轉座子等機制介導的新重復基因的起源和進化研究。兩個團隊的合作推動了對TnpB的挖掘。研究工作得到科學技術部、中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項、農業(yè)農村部和國家自然科學基金委員會等的支持。

動物所開發(fā)出新型TnpB微型基因編輯工具

來源：中科院