2023年6月20日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧教授課題組在Cell Discovery上發(fā)表了題為“Structural and mechanistic insights into the DNA glycosylase AAG-mediated base excision in nucleosome”的研究論文。論文利用冷凍電鏡技術(shù)闡明了DNA糖基化酶（DNA glycosylase）在核小體（Nucleosome core particle，NCP）不同位置上的堿基切除機制。

真核生物的堿基切除修復(fù)（Base excision repair，BER）可以定位和修復(fù)染色質(zhì)中的DNA損傷?；蚪MDNA中含有大量外源損傷劑誘導(dǎo)和自發(fā)分解反應(yīng)造成的DNA堿基損傷。DNA糖基化酶可以識別并切除損傷的DNA堿基，生成一個無嘌呤/無嘧啶的位點（AP site），這個位點可以被核酸內(nèi)切酶APE1切割并在DNA上產(chǎn)生一個缺口。隨后的修復(fù)過程可以通過DNA聚合酶、DNA連接酶以及相關(guān)蛋白質(zhì)因子通過兩種途徑修復(fù)（Short-patch and long-patch BER pathways）。

烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG（3-methyladenine DNA glycosylase）可以識別包括3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），7-甲基鳥嘌呤（7-methylguanine，m⁷G），氧化腺嘌呤1,N⁶-乙醇腺嘌呤（1，N⁶-ethenoadenine, εA）和脫氨腺嘌呤次黃嘌呤（Hypoxanthine）在內(nèi)的堿基損傷。在人類中，AAG的表達改變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、自發(fā)移碼突變和多種癌癥有關(guān)。在小鼠模型中，AAG敲除小鼠容易發(fā)生肝癌和結(jié)腸直腸癌，而在AAG過表達的小鼠中，過度的AAG活性會導(dǎo)致肝毒性、致死和其它烷基化誘導(dǎo)毒性。

DNA的堿基損傷可以發(fā)生在染色質(zhì)化的真核生物基因組的所有區(qū)域，包括核小體DNA位點。核小體作為天然的屏障會阻礙BER相關(guān)蛋白對損傷位點的接觸，只有一部分面向溶劑側(cè)的DNA自由暴露。廣泛的體外研究表明，BER因子可以選擇性地定位并結(jié)合到核小體中的不同損傷位點。一般來說，AAG在某一位點的活性和該位點的可接觸性正相關(guān)，研究證實與組蛋白核心區(qū)域相互接觸的DNA具有更高的突變率，這可能由于BER因子與損傷堿基低的接觸性密不可分。在結(jié)構(gòu)上，損傷堿基的可接觸性取決于其在核小體上的平移位置和旋轉(zhuǎn)方向，面對溶劑的損傷堿基確實比封閉和嵌入的損傷堿基更容易被修復(fù)。以往的結(jié)構(gòu)研究主要聚焦在DNA糖基化酶對裸露DNA上的修復(fù)機制，但這些蛋白質(zhì)如何克服核小體施加的障礙來定位和修復(fù)核小體中的DNA堿基損傷尚不完全清楚。本研究將模擬損傷的堿基（Deoxyinosine，DI）設(shè)計在核小體DNA的不同位置上，包括不同的超螺旋（Superhelical locations，SHLs）和旋轉(zhuǎn)方向上（圖1a），這些位置分別代表了不同的SHLs上相似性的位置（-30、-50）和同一個SHL上不同旋轉(zhuǎn)方向上導(dǎo)致的溶劑可及性不同的位置，包括完全暴露（-50），封閉（-53）和嵌入（-55）的位置上。通過冷凍電鏡技術(shù)分別解析了四種包含損傷堿基的核小體結(jié)構(gòu)（Apo-state）以及核小體和DNA糖基化酶AAG的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（Post-catalytic state）。

圖1 AAG-NCP^-30AP復(fù)合物示意圖

結(jié)構(gòu)分析表明在線性或者核小體DNA底物上，AAG都使用一組同樣的保守氨基酸殘基進行相互作用，并且作用模式比較相似（圖1b—g）。重要的是，通過與不包含DI的NCP結(jié)構(gòu)比較，作者發(fā)現(xiàn)僅存在一個DI核苷酸就足以全面擾動核小體DNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致核小體DNA和組蛋白核心之間的包埋表面積減少，并且無論受損堿基的位置如何，這些核小體DNA的整體擾動都處于相似的模式：由DI引起的DNA形變在核小體DNA出口附近最為明顯。

進一步的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在形成的穩(wěn)定AAG-NCP復(fù)合物中（包括-30、-50、-53），NCP的損傷位點都已變成了APsite，處于催化后狀態(tài)（post-catalytic state）。在這些AAG-NCP^AP復(fù)合物中，AAG的結(jié)合導(dǎo)致受損堿基周圍的核小體DNA發(fā)生非常顯著但相對局部的扭曲，根據(jù)受損部位的平移和旋轉(zhuǎn)位置，AAG利用不同的機制接觸損傷的堿基。（1）對于具有高溶劑可及性的完全暴露的DNA損傷堿基，AAG具有很高活性，能直接接觸這些損傷堿基，在結(jié)構(gòu)上直接增加DNA的局部扭曲以識別損傷位點（圖2a）。（2）對于具有中等溶劑可及性的封閉的DNA損傷堿基，AAG的活性相比于完全暴露位置的AAG活性低，AAG誘發(fā)劇烈的局部的DNA扭曲，并且為了接觸到修復(fù)堿基，還需要DNA的旋轉(zhuǎn)和包含約1bp的位移去緩解核小體的造成空間障礙（圖2b）。（3）對于溶劑可及性極低的深埋位置的DNA損傷堿基，局部DNA扭曲和有限的核小體DNA位移不足以完全暴露埋藏的堿基。此時，被DI整體擾動的核小體可能更容易自發(fā)展開（nucleosome breathing），AAG可以利用這一特性來捕獲分離的末端dsDNA并使這一過程不輕易可逆。因此，在這些完全深埋的位點中，核小體DNA的部分開放可能是AAG的招募和催化的先決條件（圖2c）。

圖2 AAG介導(dǎo)的核小體堿基切除的示意圖

綜上所述，本研究解析了包含不同位置損傷的核小體結(jié)構(gòu)以及核小體和DNA糖基化酶AAG的結(jié)構(gòu)，揭示了堿基損傷對核小體穩(wěn)定性的影響，為理解DNA糖基化酶AAG如何利用核小體的結(jié)構(gòu)動力學(xué)參與核小體中的DNA堿基損傷修復(fù)提供了一個機制框架。在更廣泛的背景下，這些數(shù)據(jù)也有助于理解其它的DNA結(jié)合蛋白如何調(diào)控核小體的結(jié)構(gòu)動力學(xué)來發(fā)揮其分子功能。

高寧為本文的通訊作者。高寧實驗室的鄭呂欽（已畢業(yè)）和蔡斌（已畢業(yè)）為本文的共同第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的李晴教授提供了本實驗所需的爪蟾組蛋白的質(zhì)粒。本研究得到了國家重點研發(fā)計劃、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國家重點實驗室和北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院啟東產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新基金的經(jīng)費支持，以及冷凍電鏡平臺、北京大學(xué)電鏡實驗室、高性能計算中心、生科院儀器中心及鳳凰工程技術(shù)支持。

來源：北京大學(xué)