懷孕過程包括配子產(chǎn)生、卵子受精形成受精卵、胚胎著床、子宮內(nèi)膜蛻膜化、胎兒和胎盤發(fā)育以及最后的生產(chǎn)。胚胎著床是胎兒與母體的首次接觸，著床后的子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和功能的改變，即子宮內(nèi)膜蛻膜化過程，最后形成蛻膜組織。該組織由多種免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等組成，為早期胎兒生長的物質(zhì)交換、能量傳遞提供場所，對成功妊娠極其重要^[1-4]。

近幾年，多篇研究利用單細(xì)胞及空間多組學(xué)聚焦于人體母胎界面的深入探究，包括蛻膜組織和胎盤組織的研究，詳細(xì)刻畫了人類妊娠6-20周齡子宮微環(huán)境的建立，包括母胎界面的細(xì)胞組成，細(xì)胞間相互作用和各種生物學(xué)過程^[5-7]。該階段為胎盤開始發(fā)育并逐漸產(chǎn)生功能，并非是母體和胎兒的真正意義上的第一次接觸。由于倫理和技術(shù)難題，我們無法獲得人圍著床時期的子宮內(nèi)膜樣本，因此小鼠作為唯一的哺乳動物模式生物，成為研究胚胎著床初期子宮微環(huán)境建立的最佳選擇。然而，迄今為止，小鼠著床位點的子宮內(nèi)膜組織還未進(jìn)行全面解析。

2023年9月11日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心杜鵬研究員課題組在Cell雜志在線發(fā)表了題為“Spatiotemporal insight into early pregnancy governed by immune-featured stromal cells”的研究論文。在這項研究中，作者結(jié)合使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和華大單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)^[8]首次對小鼠妊娠早期（E5.5-E9.5）著床位點的細(xì)胞組成進(jìn)行了詳細(xì)定義，并根據(jù)不同細(xì)胞的空間動態(tài)分布，鑒定出妊娠早期著床位點的8個不同功能中心，最終通過比較健康小鼠和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型小鼠著床位點功能中心的差異，進(jìn)而揭示了胚胎著床初期蛻膜微環(huán)境建立及穩(wěn)態(tài)維持是成功妊娠至關(guān)重要的條件。

論文截圖

在本研究工作中，作者主要有以下發(fā)現(xiàn)：

1、小鼠妊娠早期著床位點的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

作者首先對健康小鼠妊娠早期（E5.5-E10.5）著床位點的蛻膜組織和胚外組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，對母體和胚胎來源的細(xì)胞類型（共53,112個細(xì)胞）進(jìn)行系統(tǒng)定義（圖1）。同時對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（Decidual stromal cells，DSCs）、免疫細(xì)胞、母體來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行亞群定義，描述了細(xì)胞亞群比例隨蛻膜過程的動態(tài)變化。研究人員聯(lián)合使用免疫熒光染色和asmFISH技術(shù)初步勾勒出蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的空間分布。

圖1. 小鼠妊娠早期著床位點的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜構(gòu)建

2、小鼠妊娠早期著床位點單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組圖譜和功能中心鑒定

作者使用華大基因組開發(fā)的Stereo-seq技術(shù)，對小鼠妊娠早期E6.5-E9.5著床位點進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本文首次鑒定出著床位點的主要由蛻膜組織細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞等所組成的8個功能中心（functional hub，hub I-VIII）。其中，功能中心I至III主要由蛻膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，是蛻膜化過程的主要發(fā)生區(qū)域；功能中心IV（免疫招募中心）富含免疫細(xì)胞；而功能中心V（血管生成中心）則富集血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成相關(guān)的蛻膜細(xì)胞亞群（圖2）。功能中心的細(xì)胞比例和空間位置分布隨時間的動態(tài)變化代表妊娠過程中關(guān)鍵生物學(xué)事件的發(fā)生。

圖2. 小鼠妊娠早期著床位點的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組圖譜構(gòu)建和功能中心定義

3、胚胎著床初期子宮內(nèi)膜蛻膜化過程

研究者接下來對著床位點微環(huán)境中的6個子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞型，依據(jù)其差異基因和富集的生物學(xué)功能通路進(jìn)行命名，主要包括: 未分化的基質(zhì)細(xì)胞（D1）、MET轉(zhuǎn)變過程的中間態(tài)細(xì)胞（D2）、成熟的功能性細(xì)胞（D3-D6）和成熟后的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（D7）。同時作者基于擬時間分析和體外蛻膜誘導(dǎo)實驗結(jié)果，詳細(xì)描述了胚胎著床初期子宮內(nèi)膜細(xì)胞蛻膜化的間充質(zhì)-上皮樣轉(zhuǎn)換過程，主要包括從未分化狀態(tài)到增殖狀態(tài)（D3）的轉(zhuǎn)變，隨后產(chǎn)生兩種功能分支，包括在系膜側(cè)（M）產(chǎn)生與血管形成相關(guān)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（D6）以及系膜對側(cè)產(chǎn)生（AM）與營養(yǎng)供給相關(guān)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞群（D5），最終走向凋亡（圖3）。

圖3. 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程和細(xì)胞的空間分布

4、雙特征蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞型（iDSC）的分子特征和空間分布

研究者在對細(xì)胞進(jìn)行亞群分析過程中，發(fā)現(xiàn)一群特殊的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞群，整體轉(zhuǎn)錄組與血管生成相關(guān)的DSC亞群相似。基因富集分析發(fā)現(xiàn)，該群細(xì)胞高表達(dá)免疫活動相關(guān)基因（如Cxcl2、Ccl6、Gzma/e、Tnfrsf9和Spp1等），通路富集分析顯示具有“白細(xì)胞增殖”和“抗原呈遞”的功能。因此，將其命名為iDSC（immune-featured DSC）。隨后，進(jìn)一步基于轉(zhuǎn)錄組差異分為3個亞群: iDSC0/1/2，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Stereo-seq，免疫熒光染色和ISS（in situ sequence）結(jié)果顯示該三個亞群隨著妊娠過程呈現(xiàn)不同的空間定位，并最終在E8.5之后分布于免疫招募和血管生成中心。其中iDSC0高表達(dá)與血管發(fā)育相關(guān)的基因（如: Angpt2、Runx1、Jcad和Adam12）；iDSC1亞群高表達(dá)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（如: Clec4a2、Cxcl2、Ccl6和Aif1）；iDSC2高表達(dá)細(xì)胞溶解和凋亡相關(guān)的基因（如: Prf1、Gzma/e、Tnfrsf9和Spp1）?？臻g定位上，iDSC0和iDSC2主要位于血管生成中心，iDSC1位于免疫招募中心（圖4）。綜合iDSC亞群分子特征和空間定位，由此推測，iDSC三個亞群分別在免疫反應(yīng)和血管生成等生物學(xué)活動中扮演重要角色。

圖4. 雙特征蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞型（iDSC）的分子特征和空間分布

5、iDSC蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞型幫助蛻膜微環(huán)境的建立和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)

作者進(jìn)一步關(guān)注妊娠早期微環(huán)境，結(jié)合各細(xì)胞類群空間定位以及著床位點細(xì)胞間的信號通路分析，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，iDSC2亞群高表達(dá)Tnfrsf9基因，從而增強顆粒酶和穿孔素等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。iDSC0亞群和血管形成相關(guān)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞群隨妊娠進(jìn)程與各種血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)高度一致的空間定位，并且高表達(dá)血管生成信號如：VEGF、ANGPT（L）、CALCR和CHEMERIN等的配體基因，使得靜脈/動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在系膜側(cè)區(qū)域（mesometrial region）富集，并最終形成血管生成中心。另外，iDSC1高表達(dá)CXCL和CCL趨化因子，招募免疫細(xì)胞在E9.5時聚集形成一個位于兩層未分化的基質(zhì)細(xì)胞（D1_eSFs, endometrial stromal fibroblasts）的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即免疫招募中心。體外細(xì)胞毒性實驗室和細(xì)胞遷移實驗也均證明了iDSCs的不同功能。最終，iDSCs和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞群共同作用完成了著床位點各功能中心的特化和物理分隔，從而減少生物學(xué)活動潛在的相互干擾（圖5）。

圖5. 胚胎著床初期功能區(qū)域特化和穩(wěn)態(tài)建立過程

6、異常的iDSC空間分布導(dǎo)致著床位點功能中心的紊亂

最后，作者通過比較健康小鼠和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型的著床位點細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間位置分布差異發(fā)現(xiàn)，iDSC三個亞群相較于其他蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞群具有更強的功能失調(diào)表型，包括免疫招募通路的趨化因子表達(dá)上調(diào)，以及血管成熟信號下調(diào)。同時，iDSC1亞群異常定位于血管生成中心，導(dǎo)致免疫細(xì)胞異常富集在血管生成中心，致使血管生成過程異常（圖6）。由此推測，空間定位和分子異常的iDSC致使著床位點的功能中心特化失敗，并最終導(dǎo)致妊娠失敗。

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圖6. 異常的iDSC亞型對著床早期微環(huán)境功能中心特化的影響

綜上，此項研究結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組首次刻畫出小鼠妊娠早期著床位點的時空圖譜，解析了胚胎著床后子宮微環(huán)境的建立和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程，包括功能中心的特化，以及各功能中心所發(fā)生的復(fù)雜生物學(xué)事件。同時提示，細(xì)胞異常的空間定位與疾病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，為單細(xì)胞空間組學(xué)對疾病或腫瘤的研究提供新的方向和線索。

模式圖表示iDSC蛻膜基質(zhì)細(xì)胞亞群異常導(dǎo)致妊娠早期子宮微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)

杜鵬為該論文的通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院畢業(yè)博士生楊敏和生命科學(xué)學(xué)院博士后翁建莉為本文的并列第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陶偉教授，博士研究生孟繁舉、張飛翔，博士后申輝，勃林格殷格翰的Kerstin Kitt和劉騰飛博士對本文有重要貢獻(xiàn)。

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來源：北京大學(xué)