2023年10月2日，北京大學(xué)深圳研究生院全軍民教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中山大學(xué)卜憲章教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications在線發(fā)表了題為“Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation”的研究論文，這項(xiàng)研究通過靶向PPIs（蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用）環(huán)肽庫的體外篩選，鑒定出一類新型cGAS環(huán)肽抑制劑。聯(lián)合團(tuán)隊(duì)通過分子模擬、體外生化實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該抑制劑靶向cGAS和dsDNA之間的蛋白質(zhì)-DNA界面，破壞dsDNA和cGAS之間的相互作用，進(jìn)一步抑制dsDNA誘導(dǎo)的cGAS液液相分離（LLPS）。同時(shí)，優(yōu)化的類似物XQ2B在體外和體內(nèi)抑制了單純皰疹病毒-1（HSV-1）誘導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)，并增強(qiáng)了HSV-1感染。此外，XQ2B顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細(xì)胞中I型干擾素和促炎細(xì)胞因子水平的升高以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。這項(xiàng)工作為突破現(xiàn)有cGAS抑制劑臨床應(yīng)用的局限性提供了新的思路，也為自身免疫及自身炎癥性疾病的治療提供新的策略。

論文發(fā)表封面

cGAS-STING信號通路是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。cGAS作為異常胞漿DNA的重要傳感器，在病原體入侵和細(xì)胞應(yīng)激時(shí)被活化并進(jìn)一步激活下游銜接蛋白STING（干擾素基因刺激因子），進(jìn)而啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)。cGAS通過誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISG）的表達(dá)，在抗病毒反應(yīng)和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。相反，cGAS-STING通路的異常激活已被證明是自身免疫性和自身炎癥性疾病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制。TREX1是負(fù)責(zé)降解胞質(zhì)DNA的核酸外切酶，其功能缺失突變導(dǎo)致胞質(zhì)dsDNA的積累和cGAS-STING途徑的異常激活，隨后引發(fā)自身免疫性疾病如Aicardi-Goutières綜合征（AGS）或凍瘡性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）。此外，各種細(xì)胞損傷引起的線粒體DNA應(yīng)激也通過觸發(fā)cGAS活性促進(jìn)炎癥反應(yīng)。cGAS在先天免疫和自身炎癥反應(yīng)中的重要作用支持cGAS作為cGAS活性異常相關(guān)疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。

近年來，人們致力于開發(fā)強(qiáng)效和特異性cGAS抑制劑，靶向cGAS活性位點(diǎn)的多種化學(xué)支架的cGAS抑制劑已通過高通量篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，并通過藥物化學(xué)進(jìn)行了優(yōu)化。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)配體結(jié)合口袋不同，蛋白質(zhì)-DNA界面的溶劑暴露、高正電荷和平坦的特性使開發(fā)具有類藥物性質(zhì)的小分子抑制劑具有挑戰(zhàn)性。大環(huán)肽已被證明是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs，開發(fā)小分子抑制劑的具有挑戰(zhàn)性的界面）的有效工具，因?yàn)樗鼈兙哂懈咝Я瓦x擇性，因此大環(huán)肽成為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-DNA界面的潛在骨架。

為了從大環(huán)肽庫中篩選靶向蛋白質(zhì)-DNA界面的cGAS抑制劑，作者應(yīng)用了一種基于RNA的熒光生物傳感器來檢測2’，3′-cGAMP，用于體外篩選cGAS活性抑制劑，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選驗(yàn)證。在體外蛋白水平和細(xì)胞水平測定中苗頭分子（hits）之間的抑制活性差異可能歸因于它們不同的細(xì)胞滲透性，作者鑒定出XQ2在細(xì)胞測定中具有最佳cGAS抑制活性，并進(jìn)一步驗(yàn)證了XQ2特異性抑制人源和鼠源細(xì)胞中dsDNA誘導(dǎo)的cGAS活化和cGAS-STING信號傳導(dǎo)。接下來，作者在體外通過表面等離子體共振（SPR）、微量熱泳動(dòng)（MST）以及熒光偏振（FP）等技術(shù)分析表明XQ2與GAS直接結(jié)合，并阻斷cGAS與DNA的相互作用。值得關(guān)注的是他們的數(shù)據(jù)顯示胞內(nèi)高濃度的ATP/GTP顯著促進(jìn)XQ2與cGAS的結(jié)合親和力（K_d= 4.5 ± 1.6 μM vs K_d= 45.3 ± 26.9 μM），該作用模式與目前報(bào)道的cGAS抑制劑活性因胞內(nèi)ATP/GTP競爭而減弱顯然不同。作者進(jìn)一步結(jié)合分子對接及定點(diǎn)突變闡明XQ2與cGAS的潛在結(jié)合模式。

XQ2與cGAS結(jié)合并阻斷cGAS-DNA相互作用

DNA誘導(dǎo)的cGAS液液相分離（LLPS）在調(diào)節(jié)酶活性和先天免疫信號傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。鑒于XQ2對dsDNA與cGAS結(jié)合的抑制作用，作者進(jìn)一步在體外蛋白水平和細(xì)胞水平驗(yàn)證了XQ2以劑量依賴的方式有效抑制DNA誘導(dǎo)的cGAS液液相分離。

XQ2抑制DNA誘導(dǎo)的cGAS液液相分離

為了評估XQ2B的臨床應(yīng)用價(jià)值，作者利用自身免疫性疾病模型——Trex1^-/-小鼠，進(jìn)一步驗(yàn)證了XQ2B顯著抑制了Trex1^-/-小鼠原代巨噬細(xì)胞中I型干擾素和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，表明XQ2B有效地減輕了Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，突出了靶向蛋白質(zhì)-DNA界面的cGAS特異性抑制劑在cGAS相關(guān)自身免疫性疾病中的治療潛力。

XQ2B抑制Trex1^-/-小鼠的全身炎癥

總之，這項(xiàng)研究通過體外生化實(shí)驗(yàn)、分子模擬、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等技術(shù)手段，成功鑒定出一類全新作用機(jī)制的cGAS環(huán)肽類抑制劑，靶向蛋白質(zhì)-DNA界面，并阻斷DNA誘導(dǎo)的cGAS液相縮合和活化。一種優(yōu)化的類似物XQ2B在體外和體內(nèi)抑制HSV-1誘導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)，并顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細(xì)胞中I型干擾素和促炎細(xì)胞因子水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。XQ2B作為首例靶向蛋白-DNA界面及液液相分離的特異性cGAS抑制劑，為進(jìn)一步開發(fā)cGAS相關(guān)自身免疫性和自身炎癥性疾病藥物提供新的思路。

北京大學(xué)深圳研究生院博士研究生王小權(quán)和中山大學(xué)博士研究生王尤橋?yàn)樵撜撐牡牟⒘械谝蛔髡?，全軍民和卜憲章為該論文的共同通訊作者。為本文作出貢獻(xiàn)的作者還有：北京大學(xué)深圳研究生院博士研究生曹安琪、羅欽宏博士、李勤凱博士，遵義醫(yī)科大學(xué)陳道遠(yuǎn)博士，浙江大學(xué)博士研究生趙瑋琦、許軍博士。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、深圳市科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目、深圳基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目和廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目的支持。

來源：北京大學(xué)深圳研究生院