近日，瑞士蘇黎世大學(xué)的科學(xué)家們通過(guò)一項(xiàng)名為REVeRT（mRNA跨剪接雙AAV載體技術(shù)）的新技術(shù)，成功展示了他們能夠重新組裝并表達(dá)大型基因。這一技術(shù)基于mRNA跨剪接，可實(shí)現(xiàn)多功能的分割位點(diǎn)選擇，以及在各種體外模型、人體器官樣本以及體內(nèi)環(huán)境中高效地重組不同分割的基因，包括用于基因組和表觀基因組編輯的主編輯器和CRISPR激活劑。REVeRT還可以通過(guò)單一或多重劑量給予，以靶向多種小鼠組織和器官中的基因。REVeRT的靈活性和高效性使其成為臨床和基礎(chǔ)研究應(yīng)用的極具前景的工具。

這項(xiàng)研究成果已經(jīng)發(fā)表在《自然通訊》（Nature Communications）雜志上，題為“mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy”?。

雙AAV載體用于大型基因重組 大型基因，如CRISPR-Cas模塊中的基因激活劑（CRISPRa），需要雙AAV載體以實(shí)現(xiàn)高效的體內(nèi)傳遞和表達(dá)。當(dāng)前雙AAV載體方法的主要缺點(diǎn)是重組效率較低，也稱為“DNA跨剪接”。

為了克服這一限制，已經(jīng)開發(fā)了幾種方法，它們都使用相同的基本思想：興趣基因被分成兩部分，并分別打包到不同的AAV載體中，稱為雙AAV。在兩個(gè)AAV載體同時(shí)傳遞到目標(biāo)組織后，分割的基因部分可以在AAV基因組、mRNA或蛋白質(zhì)水平重新組裝。

在AAV基因組水平的基因重組的各種版本依賴于AAV基因組同源重組或串聯(lián)化。然而，在AAV基因組水平上的DNA跨剪接通常導(dǎo)致重組效率較低。使用分割內(nèi)源子（自剪接氨基酸序列）的方法在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行工作，通常具有非常高的重組效率。然而，分割內(nèi)源子方法不夠靈活，產(chǎn)生相等數(shù)量的免疫原或致病內(nèi)源子，引發(fā)了翻譯方法的嚴(yán)重安全擔(dān)憂。

鮮有關(guān)于通過(guò)雙mRNA跨剪接的AAV重組的研究。在DNA跨剪接中，mRNA剪接在同一RNA分子上發(fā)生，并在成功重組基因組之后清除了分割片段之間的非編碼部分。雖然一些在mRNA跨剪接中使用的序列元素與DNA跨剪接中使用的元素相同，如互補(bǔ)區(qū)域和剪接位點(diǎn)，但重組發(fā)生在兩個(gè)不同的mRNA分子之間。

直到現(xiàn)在，mRNA跨剪接和AAV只在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中用于表達(dá)CFTR基因一次。盡管如此，它尚未經(jīng)過(guò)充分的安全性或有效性測(cè)試，并且尚未在活體生物、疾病模型或基因編輯方法中有效使用。

使用mRNA跨剪接實(shí)現(xiàn)大型基因重組 來(lái)自Elvir Becirovic實(shí)驗(yàn)室的Lisa Maria Riemayer博士和她的同事們開發(fā)了REVeRT，這是一種靈活且高效的雙AAV載體技術(shù)，基于mRNA跨剪接。他們展示了REVeRT可以用于恢復(fù)CRISPR激活劑（CRISPRa）和主編輯器的功能，以及在各種組織中添加大于單個(gè)AAV載體所能攜帶的疾病相關(guān)基因。例如，Cas9-VPR29，這是最強(qiáng)大的CRISPRa模塊之一，太大以至于無(wú)法容納在單個(gè)AAV載體中。REVeRT可以在多種治療相關(guān)的組織和器官中（包括視網(wǎng)膜、心臟、肺、肝臟、骨骼肌和大腦）功能性地重組完整的Cas9-VPR。

使用雙REVeRT AAV載體，Reidmayr博士和她的同事們還展示了一種體內(nèi)多重激活和抑制基因的方法。結(jié)合具有不同間隔長(zhǎng)度的sgRNA來(lái)同時(shí)靶向不同的基因座位，允許同時(shí)敲除和激活（CONNACT）多個(gè)基因。CONNACT可以治療需要有效抑制有缺陷等位基因并插入額外基因來(lái)彌補(bǔ)失去功能的情況，如某些遺傳病。

此外，CONNACT策略還可以作為治療涉及多個(gè)基因或通路的其他疾病的平臺(tái)，如癌癥或神經(jīng)退行性疾病。使用REVeRT和CONNACT可以同時(shí)激活抑制腫瘤的基因并關(guān)閉致癌基因，或關(guān)閉促凋亡或?qū)?xì)胞有害的基因并同時(shí)打開神經(jīng)保護(hù)基因。

蘇黎世大學(xué)的研究人員還在小鼠中進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，通過(guò)眼內(nèi)注射使用雙REVeRT載體技術(shù)，以治療導(dǎo)致失明的遺傳病，通常是由大型ABCA4基因的突變引起的。他們獲得了初步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)暗示在Stargardt小鼠模型中改善了視網(wǎng)膜退行和功能。然而，需要更大的動(dòng)物隊(duì)列和額外的功能測(cè)量來(lái)充分評(píng)估REVeRT技術(shù)在Stargardt基因療法中的治療效果。

由于REVeRT在給予腹腔內(nèi)注射后仍然在許多組織或器官中表現(xiàn)出良好的效果，這可能使治療某種疾病更加容易，特別是如果局部給藥途徑不起作用或需要同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)多個(gè)器官。盡管REVeRT在效力方面取得了高度有希望的結(jié)果，但需要在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)一步調(diào)查其耐受性、毒性或免疫反應(yīng)等安全參數(shù)，然后才能用于臨床試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：“mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy,”

編輯：王洪

排版：李麗