5月20日，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心惠利健研究組聯(lián)合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院夏強(qiáng)團(tuán)隊(duì)、華東師范大學(xué)李大力團(tuán)隊(duì)、上海科技大學(xué)iHuman研究所鐘桂生團(tuán)隊(duì)，在《細(xì)胞-干細(xì)胞》（Cell Stem Cell）上在線發(fā)表了題為Efficient expansion and CRISPR-Cas9-mediated gene correction of patient-derived hepatocytes for treatment of inherited liver diseases的研究論文。該研究建立了高效的肝臟遺傳代謝性病人來(lái)源的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)了多種病人來(lái)源肝細(xì)胞的體外長(zhǎng)期大量擴(kuò)增。在此基礎(chǔ)上，科研人員優(yōu)化并建立了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲入技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在遺傳代謝性疾病病人來(lái)源的增殖肝細(xì)胞中高效定點(diǎn)糾正病人缺陷基因。此外，基因編輯的增殖肝細(xì)胞移植可以高效整合、再殖小鼠肝臟，并成功治療酪氨酸血癥小鼠模型，證明了體外基因糾正的增殖肝細(xì)胞治療的有效性。該研究建立了高效的肝臟遺傳代謝性疾病病人來(lái)源肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)和基因編輯技術(shù)，為人類肝臟遺傳代謝性疾病的自體肝細(xì)胞治療提供了概念上的驗(yàn)證。

肝臟作為人體新陳代謝的中心器官，其中的肝細(xì)胞是肝臟功能最主要的承擔(dān)者。肝細(xì)胞中的一些關(guān)鍵功能基因的突變會(huì)導(dǎo)致危及生命的肝臟遺傳代謝性疾病發(fā)生。這類疾病的致病基因較多并且病情嚴(yán)重，但目前除肝移植外尚無(wú)有效的治療方式。肝細(xì)胞在移植后具有很強(qiáng)的肝臟再殖能力，一些患有肝臟遺傳性疾病的動(dòng)物模型通過(guò)肝細(xì)胞移植后得以治愈。因此，肝細(xì)胞移植作為替代肝器官移植治療肝臟遺傳代謝性疾病的治療方式具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，前期的基礎(chǔ)和臨床研究表明，異體肝細(xì)胞治療的長(zhǎng)期有效性受限于移植后細(xì)胞的免疫排斥。因此，避免移植后細(xì)胞的免疫清除是實(shí)現(xiàn)病人肝細(xì)胞治療的核心難題。

惠利健團(tuán)隊(duì)致力于新型肝細(xì)胞來(lái)源和終末期肝臟疾病治療的研究。為了探討肝臟遺傳性疾病患者來(lái)源肝細(xì)胞的體外擴(kuò)增及基因修復(fù)后的回輸治療，科研人員著手于分離和培養(yǎng)肝臟遺傳性疾病患者來(lái)源的人原代肝細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的增強(qiáng)型肝細(xì)胞培養(yǎng)基，能夠促使10種不同疾病基因突變所致的遺傳代謝性疾病患者來(lái)源的肝細(xì)胞在體外迅速增殖，且同一疾病的多個(gè)患者表現(xiàn)出相似的培養(yǎng)結(jié)果。研究顯示，經(jīng)過(guò)連續(xù)的細(xì)胞傳代擴(kuò)增，從1克肝組織中分離的肝細(xì)胞理論上可以擴(kuò)增至1000倍，可達(dá)到5×10⁹數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增肝細(xì)胞，為后續(xù)治療提供了的細(xì)胞來(lái)源。

進(jìn)一步，該研究采用在可增殖的人肝細(xì)胞（ProliHHs）基因組中定點(diǎn)基因敲入的治療策略來(lái)糾正患者的基因缺陷。為了更貼近當(dāng)前基因編輯細(xì)胞的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，研究采用電轉(zhuǎn)的方法將Cas9-sgRNA蛋白復(fù)合體和外源基因片段（Donor）遞送至ProliHHs，以進(jìn)行基因定點(diǎn)敲入表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化ProliHHs細(xì)胞的電轉(zhuǎn)程序、Donor的定向整合策略和AAV亞型篩選，研究實(shí)現(xiàn)了高水平的敲入效率。同時(shí)，經(jīng)過(guò)基因編輯的細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞保持相對(duì)穩(wěn)定編輯效率。此外，科研人員嘗試富集基因編輯后的ProliHHs，并對(duì)其功能蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。為驗(yàn)證編輯后患者細(xì)胞的治療效果，研究培養(yǎng)了酪氨酸血癥患者來(lái)源的肝細(xì)胞，并通過(guò)基因敲入方式糾正了患者缺陷的FAH基因。移植后，基因編輯后的ProliHHs整合到FRG小鼠肝臟中，實(shí)現(xiàn)了小鼠模型的治療效果。

研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科學(xué)技術(shù)部、中國(guó)科學(xué)院和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)等的資助，并獲得分子細(xì)胞卓越中心分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)、化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的支持。

論文鏈接

基因編輯糾正病人來(lái)源可增殖人肝細(xì)胞實(shí)現(xiàn)遺傳代謝性肝臟疾病治療

來(lái)源：中科院