細(xì)胞核是遺傳物質(zhì)的主要存儲區(qū)和加工、調(diào)控中心。基因組DNA受到損傷后，細(xì)胞核內(nèi)隨即開啟一系列由多種蛋白參與的協(xié)同有序的復(fù)雜修復(fù)過程。但由于核膜的屏障和細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的組成環(huán)境，對活細(xì)胞的細(xì)胞核中內(nèi)源性核酸修復(fù)蛋白的原位動態(tài)觀測是一個極具挑戰(zhàn)性的難題。

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（APE1）是一種重要的核酸修復(fù)蛋白，在堿基切除修復(fù)（BER）途徑中發(fā)揮核心作用，同時還是許多轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原激活劑，并參與RNA的加工等。2024年3月30日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院趙美萍課題組在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在線發(fā)表了題為“Live-cell imaging of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in the nucleus and nucleolus using a chaperone@DNA probe”的研究論文。該研究報道了一種全新的由蛋白分子伴侶保駕護(hù)航的DNA熒光探針，在確保對APE1具有特異性響應(yīng)的同時，實現(xiàn)了探針的細(xì)胞核靶向，首次對活細(xì)胞核內(nèi)不同區(qū)域的APE1進(jìn)行了動態(tài)可視化觀測。

研究團(tuán)隊在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，將生物素標(biāo)記的含缺堿基位點的DNA（AP-DNA）通過親和素（AVD）組裝在二氧化硅包覆的磁性納米顆粒表面時，該AP-DNA可以自然抵抗多種核酸酶的酶切，但卻可以被APE1有效地識別和定點切割（Nucleic Acids Res. 2017, 45, e45; J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 16925）。隨后的研究表明，生物素標(biāo)記不僅將AP-DNA探針錨定在親和素分子上，同時還顯著提高了AVD對APE1結(jié)合的親和力?；谛掳l(fā)現(xiàn)的APE1-AVD-DNA三元體系兩兩互作的協(xié)同效應(yīng)，研究團(tuán)隊創(chuàng)建了一種全新的蛋白分子伴侶策略來實現(xiàn)對DNA探針的保護(hù)（圖1）。

圖1 ACP熒光探針的構(gòu)建、選擇性和對不同類型細(xì)胞的細(xì)胞器中APE1的定量測定

研究團(tuán)隊利用特異性抑制劑、免疫沉淀法和基因敲除細(xì)胞系等確證了ACP探針的特異性，對不同類型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和外泌體等提取蛋白中的APE1含量進(jìn)行了定量比較。數(shù)據(jù)反映出不同細(xì)胞間細(xì)胞核內(nèi)APE1的含量差異巨大，而細(xì)胞質(zhì)中的APE1含量差別較小。

作者進(jìn)一步用苯硼酸衍生物共價修飾AVD，制得的探針（PB-ACP）通過輸入蛋白α/β途徑靶向細(xì)胞核的能力在多種細(xì)胞系中都得到了證實（圖2）。研究揭示出APE1在基因表達(dá)活躍和DNA損傷程度較高的常染色質(zhì)區(qū)域活性較高，在核仁區(qū)有明顯的分布，而在異染色質(zhì)區(qū)分布相對較少。

圖2 由苯硼酸修飾親和素構(gòu)建的分子伴侶@DNA熒光探針（PB-ACP）及其在不同類型活細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)對內(nèi)源APE1的熒光響應(yīng)

APE1在細(xì)胞內(nèi)不同的區(qū)域中發(fā)揮著不同的作用，其在細(xì)胞核中的分布和動態(tài)遷移與其執(zhí)行多種功能密切相關(guān)。作者進(jìn)一步展示了細(xì)胞在受到不同類型刺激時APE1活性和分布的變化（圖3）。

圖3 在不同條件刺激下活細(xì)胞內(nèi)APE1活性和分布的變化

該研究為在活細(xì)胞水平全面理解核酸損傷修復(fù)的動態(tài)過程和分子機(jī)理提供了新穎、高效的分子工具，對深入研究細(xì)胞衰老機(jī)制、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展和針對性治療等有積極的推動作用。研究提出的分子伴侶協(xié)助核酸探針策略也為未來進(jìn)一步開發(fā)更加智能化的核酸探針開拓了一種全新的模式。

北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院已畢業(yè)博士生曹翔劍、在讀博士生鄭菁卉和張芮蘭為該論文的共同第一作者，趙美萍為通訊作者。北京大學(xué)分析測試中心（PKUAIC）的關(guān)妍和周文分別對熒光成像和質(zhì)譜分析提供了很大幫助。該研究得到國家自然科學(xué)基金委員會和北京分子科學(xué)國家研究中心的資助與支持。

來源：北京大學(xué)