在早期胚胎發(fā)育過程中，胚胎著床是一個(gè)極為關(guān)鍵的生物學(xué)事件。其間胚胎植入母體子宮，建立母胎交流界面，這是后續(xù)發(fā)育的基礎(chǔ)。然而這一過程充滿風(fēng)險(xiǎn)，臨床上常常出現(xiàn)因著床失敗導(dǎo)致的生育問題。由于該過程極為瞬時(shí)和動(dòng)態(tài)，胚胎著床方面的研究仍是一個(gè)“黑匣子”。

miRNA是真核生物中保守的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，并在著床過程中起到重要作用。DGCR8是miRNA合成通路的核心蛋白，它與DROSHA一起組成Microprocessor復(fù)合體，切割pri-miRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成pre-miRNA，pre-miRNA再進(jìn)一步被加工為成熟的miRNA。¹ DCGR8敲除后，胚胎無法發(fā)育至著床后階段，暗示著DGCR8在著床過程中起到重要作用，然而該致死表型卻不能完全用miRNA的缺陷來解釋。^2,3

與尚不清楚的著床期過程相比，人們對(duì)于著床前胚胎和著床后的胚胎已有廣泛的研究，這主要得益于體外干細(xì)胞模型的建立。由著床前胚胎分離得到的干細(xì)胞被稱為na?ve mESCs（小鼠胚胎干細(xì)胞），而著床后胚胎分離得到的干細(xì)胞被稱為Formative/Primed mESCs，這幾種細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用各種發(fā)育問題的研究。^4,5?北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心/北京大學(xué)核糖核酸北京研究中心的杜鵬教授課題組在2018年捕捉到了一種介于naive和Formative/primed多能性的中間態(tài)多能性干細(xì)胞，稱為Poised mESCs。^6,7 該狀態(tài)代表了處于著床期的胚胎，且由一組特異的miRNA所調(diào)控。

2024年7月1日，杜鵬課題組在Molecular cell雜志在線發(fā)表了題為“A transient transcriptional activation governs unpolarized-to-polarized morphogenesis during embryo implantation”的研究論文。在本研究中，研究者運(yùn)用na?ve-poised-formative/Primed等干細(xì)胞模型，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室先前在miRNA調(diào)控方面的研究基礎(chǔ)，解釋了驅(qū)動(dòng)著床期胚胎形狀建成的分子驅(qū)動(dòng)力，主要內(nèi)容概括如下：

1. DGCR8作為miRNA合成通路的核心蛋白，可以發(fā)揮不依賴于miRNA的轉(zhuǎn)錄抑制的非經(jīng)典功能。在na?ve mESCs中（代表著床前胚胎），DGCR8可以結(jié)合位于mRNA上短的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，招募并隔離轉(zhuǎn)錄激活子FLII，抑制轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。在Poised mESCs中（代表著床中胚胎），ERK通路瞬時(shí)激活，使得FLII受到磷酸化修飾并與DGCR8解離，進(jìn)而與轉(zhuǎn)錄因子JUN結(jié)合并激活細(xì)胞遷移基因的轉(zhuǎn)錄。著床后ERK通路迅速失活（Formative mESCs），DGCR8重新結(jié)合并抑制FLII。因此DGCR8/FLII/JUN在ERK通路的介導(dǎo)下，在著床期特異地介導(dǎo)了一個(gè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活事件的發(fā)生（圖1）。

2. 該轉(zhuǎn)錄激活事件控制了胚胎著床期由無序狀態(tài)到極化狀態(tài)的形態(tài)轉(zhuǎn)變，且該事件在人和小鼠是保守的（圖1）。

圖1. 在著床前（naive）-著床中（Poised）-著床后（Formative）發(fā)育過程中，DGCR8/FLII/JUN在ERK通路調(diào)控下介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活事件的發(fā)生，進(jìn)而調(diào)控著床期胚胎形態(tài)轉(zhuǎn)變

本研究具體結(jié)論如下：

一、在na?ve mESCs中，DGCR8通過結(jié)合mRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，招募并抑制轉(zhuǎn)錄激活子FLII。

基于前期的na?ve小鼠胚胎干細(xì)胞中DGCR8互作蛋白數(shù)據(jù)/Co-IP/Pull down，作者發(fā)現(xiàn)，DGCR8與轉(zhuǎn)錄激活子FLII存在直接的蛋白相互作用。然而FLII并不參與miRNA合成通路。進(jìn)一步的通過遺傳學(xué)手段，作者發(fā)現(xiàn)：DGCR8和FLII共同在轉(zhuǎn)錄水平上控制了一組不受miRNA調(diào)控的基因，該類基因主要參與細(xì)胞遷移等活動(dòng)，稱為非miRNA靶向基因。DGCR8可以抑制，但FLII可以激活此類基因的轉(zhuǎn)錄。

為了進(jìn)一步研究DGCR8如何抑制這類基因的轉(zhuǎn)錄，在na?ve小鼠胚胎干細(xì)胞中，作者通過eCLIP實(shí)驗(yàn)鑒定了DGCR8/FLII的RNA結(jié)合靶點(diǎn)，同時(shí)在eCLIP實(shí)驗(yàn)中還摻入了S4U，可以同時(shí)鑒定出新生的RNA（nascent RNA）。作者發(fā)現(xiàn)DGCR8和FLII同時(shí)結(jié)合了大量的靶基因的新生mRNA，且DGCR8結(jié)合區(qū)域傾向于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)顯著短于pri-miRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并不能被DGCR8和DROSHA形成的復(fù)合體結(jié)合并切割。通過敲除DGCR8所結(jié)合的位于靶基因mRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)被解除。這證明DGCR8確實(shí)通過結(jié)合mRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)來抑制轉(zhuǎn)錄。

綜上，這說明DGCR8一方面和DROSHA結(jié)合負(fù)責(zé)pri-miRNA的切割，一方面結(jié)合在靶基因mRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，招募并抑制轉(zhuǎn)錄激活子FLII，從而抑制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行（圖2）。

圖2. 在na?ve（代表著床前胚胎）小鼠胚胎干細(xì)胞中，DGCR8結(jié)合靶基因mRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，招募并隔離轉(zhuǎn)錄激活子FLII，抑制轉(zhuǎn)錄進(jìn)行

二、FLII在Poised mESCs（代表著床期胚胎）中與DGCR8解離，并與轉(zhuǎn)錄因子JUN結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄。

通過na?ve-poised（著床前→著床中）轉(zhuǎn)變體系，作者發(fā)現(xiàn)：FLII在只有在Poised時(shí)期（著床中）才具有轉(zhuǎn)錄激活活性，而在na?ve時(shí)期（著床前）則沒有。與此對(duì)應(yīng)的是FLII在Poised時(shí)期解除了與DGCR8的互作，同時(shí)也不再結(jié)合靶基因的mRNA。這說明FLII與DGCR8的解離是FLII具有轉(zhuǎn)錄激活活性的關(guān)鍵條件。通過一系列生化實(shí)驗(yàn)，作者證明na?ve-poised轉(zhuǎn)變過程中，ERK通路瞬時(shí)激活，磷酸化FLII，使得FLII與DGCR8不再結(jié)合。同時(shí)磷酸化的FLII會(huì)與轉(zhuǎn)錄因子JUN互作增強(qiáng)（圖3）。進(jìn)一步的通過JUN的CUT&Tag實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JUN可以廣泛結(jié)合在FLII激活的靶基因上，且JUN在Flii敲除中的細(xì)胞中無法結(jié)合靶基因。這說明JUN只有與FLII結(jié)合才能夠結(jié)合靶基因，激活其轉(zhuǎn)錄（圖3）。

圖3. 在Poised（代表著床中的胚胎）小鼠胚胎干細(xì)胞中，ERK激活誘導(dǎo)DGCR8與FLII的解離，促進(jìn)FLII與JUN形成新的復(fù)合體激活基因轉(zhuǎn)錄

三、Poised mESCs代表小鼠和人的著床期胚胎，這一時(shí)期的胚胎正經(jīng)歷無序到極化的形態(tài)轉(zhuǎn)變。

通過與體內(nèi)胚胎的轉(zhuǎn)錄組比較，作者發(fā)現(xiàn)Poised ESCs的轉(zhuǎn)錄組與小鼠與人的著床期胚胎轉(zhuǎn)錄組最為相似（小鼠為E4.75天，人為E8天）。這一時(shí)期胚胎的上胚層細(xì)胞逐漸從無序狀態(tài)變成玫瑰花環(huán)樣的極化結(jié)構(gòu)。且在體外培養(yǎng)的著床期小鼠胚胎中，能夠觀察到JUN和其他靜息態(tài)多能性標(biāo)記基因的表達(dá)，進(jìn)一步證明了已有結(jié)論。通過體外的模擬無序到極化的形態(tài)轉(zhuǎn)變體系，作者發(fā)現(xiàn)抑制該轉(zhuǎn)錄激活事件都會(huì)導(dǎo)致無序到極化結(jié)構(gòu)形態(tài)轉(zhuǎn)變的失敗。因此，本文中鑒定到的轉(zhuǎn)錄激活事件對(duì)應(yīng)于著床期胚胎，而激活基因以細(xì)胞遷移相關(guān)基因?yàn)橹?，則對(duì)應(yīng)著這一時(shí)期細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變（圖4）。

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)了DGCR8獨(dú)立于miRNA之外的轉(zhuǎn)錄抑制功能，并與FLII/JUN一起，在ERK通路的控制下，控制了著床期的瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活事件，進(jìn)而控制這一時(shí)期的形態(tài)建成。

圖4. Poised ESCs（靜息態(tài)多能性干細(xì)胞）代表著床期的小鼠/人胚胎，其epiblast正經(jīng)歷無序到極化的形態(tài)轉(zhuǎn)變。本文鑒定的轉(zhuǎn)錄激活事件對(duì)應(yīng)于這一形態(tài)轉(zhuǎn)變過程

杜鵬為該論文的通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后呂學(xué)暉、崔英姿，前沿交叉學(xué)科研究院博士后孔寅飛為本文的并列第一作者。北京大學(xué)博士畢業(yè)生楊敏、博士后申輝、博士后李詩雨、已出站博士后翁建莉，北京大學(xué)張哲研究員及其博士生廖述筠，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所王皓毅研究員及其博士畢業(yè)生安辰瑞，山東大學(xué)李艷研究員對(duì)本文有重要貢獻(xiàn)。該項(xiàng)工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，國(guó)家自然科學(xué)基金的支持。

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來源：北京大學(xué)