真核生物的基因組DNA包裹在染色質(zhì)中，因此真核DNA復(fù)制發(fā)生在染色質(zhì)環(huán)境下。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，由147bp DNA纏繞的組蛋白八聚體組成，組蛋白多種翻譯后修飾是表觀遺傳信息的承載基礎(chǔ)。DNA復(fù)制時(shí)染色質(zhì)打開然后重新建立，使得DNA復(fù)制和染色質(zhì)復(fù)制的偶聯(lián)，在此過程中親本染色質(zhì)攜帶的表觀遺傳信息被分配到新合成的子鏈DNA，因此染色質(zhì)重建也是表觀遺傳信息繼承的基礎(chǔ)，維持基因組和表觀基因組穩(wěn)定。染色質(zhì)重建的起始步驟是DNA復(fù)制偶聯(lián)的核小體組裝，同時(shí)也是表觀遺傳信息繼承的關(guān)鍵一環(huán)，其核心是DNA合成和核小體組裝的偶聯(lián)。

堿基配對形成了雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA，兩條鏈的互補(bǔ)性決定了DNA是以半保留的方式進(jìn)行復(fù)制。組成DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此解螺旋的DNA的兩條單鏈具有方向，一條是5’-3’，另一條鏈?zhǔn)?’-5’，但是DNA聚合酶都是5’-3’方向進(jìn)行合成的，導(dǎo)致復(fù)制叉上兩條鏈的合成方向相反。由此DNA復(fù)制的一條鏈?zhǔn)窍驈?fù)制叉前進(jìn)的方向連續(xù)合成，稱之為前導(dǎo)鏈，而另一條鏈的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)的方向相反，先合成小片段DNA然后連接成完整的DNA分子，這個(gè)機(jī)制是岡崎夫婦發(fā)現(xiàn)的，所以這些短片段稱之為岡崎片段，這條鏈稱之為滯后鏈。滯后鏈岡崎片段合成先是Pol α合成帶有一段RNA的DNA引物，然后發(fā)生聚合酶Pol α到 Pol δ的轉(zhuǎn)換，Pol δ繼續(xù)合成岡崎片段。其間Pol δ通過鏈置換反應(yīng)入侵前一個(gè)岡崎片段，將含有RNA的保真度較低引物置換，形成單鏈翹起，進(jìn)而招募Fen1等核酸酶進(jìn)行切除被置換的單鏈DNA，產(chǎn)生的缺口被DNA連接酶（酵母中是Cdc9）連接，保障岡崎片段成熟，形成完整連續(xù)的滯后鏈DNA。伴隨岡崎片段合成，核小體也會迅速組裝，以免DNA暴露。前期Whitehouse和Smith的研究表明，真核生物的岡崎片段大小與核小體DNA和連接DNA的長度相當(dāng)，且連接位置在核小體近中軸區(qū)，提出滯后鏈上核小體可以阻礙Pol δ的行進(jìn)決定岡崎片段的長度(1、2)。由于沒有直接證據(jù)，核小體組裝和岡崎片段成熟過程的協(xié)同機(jī)制尚不明確，李晴課題組發(fā)展了電鏡核酸技術(shù)，對此機(jī)制進(jìn)行了解析。

8月9日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心李晴教授課題組在Science Advances發(fā)表題為“DNA polymerase δ subunit Pol32 binds histone H3-H4 and couples nucleosome assembly with Okazaki fragment processing”的研究論文，巧妙利用DNA連接酶降解體系，應(yīng)用電鏡核酸技術(shù)觀察酵母細(xì)胞中DNA復(fù)制叉中間體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)核小體中組蛋白和DNA的相互作用決定了鏈置換的位置，而且DNA聚合酶δ的Pol32亞基在C端有一個(gè)組蛋白H3-H4的結(jié)合區(qū)域，可以直接貢獻(xiàn)于后隨鏈上的核小體組裝，揭示了后隨鏈上DNA合成和核小體組裝的協(xié)同機(jī)制。

研究者在芽殖酵母中利用AID（Auxin-induced degradation）系統(tǒng)誘導(dǎo)Cdc9在DNA復(fù)制早期快速降解，抑制岡崎片段末端的連接，進(jìn)而在透射電鏡下觀察DNA復(fù)制中間體，發(fā)現(xiàn)在超過94%的復(fù)制叉上都含有翹起的DNA結(jié)構(gòu)（flap structure），并且這個(gè)翹起結(jié)構(gòu)主要集中在其中一條子鏈上，進(jìn)一步的分析表明有翹起發(fā)生在滯后鏈(圖1)。通過測量翹起結(jié)構(gòu) (Flap)的兩個(gè)主要特征(圖2)：Flap本身的長度和相鄰Flap的間距，研究者發(fā)現(xiàn)，1)在野生型背景下，F(xiàn)lap的長度集中分布在52nt左右，其長度受到Pol δ的鏈置換活性和Fen1的核酸酶活性調(diào)控，而且Flap的長度分布具有13—15nt的步長，可能是由核小體中周期性組蛋白和DNA相互作用障礙鏈置換合成造成的；2）相鄰Flap的間距與岡崎片段長度相似，集中在190bp左右。該間距的增大來自于DNA復(fù)制偶聯(lián)的核小體組裝突變，例如經(jīng)典組蛋白分子伴侶CAF-1大亞基Cac1的缺失突變（cac1?）以及Mcm2結(jié)合組蛋白突變mcm2-3A，兩個(gè)突變分別會導(dǎo)致新合成組蛋白的組裝缺陷和舊組蛋白回收缺陷，這個(gè)間距增加到280bp左右，表明岡崎片段的合成受核小體組裝程度調(diào)節(jié)。

圖1： 電鏡核酸技術(shù)觀察DNA連接酶降解后的復(fù)制叉結(jié)構(gòu)。圖示復(fù)制泡結(jié)構(gòu)；左圖是Cdc9降解后，右圖是未降解對照

研究者在Pol δ亞基非催化亞基Pol32缺失突變中觀察到flap間距變大，和上述提到核小體組裝突變cac1?以及mcm2-3A的間距變化類似 (圖2)。研究者進(jìn)一步通過體內(nèi)、體外分析直接證明了Pol32的C端可以直接結(jié)合組蛋白H3-H4，并通過ReIN-Map方法證明Pol32調(diào)節(jié)滯后鏈上的核小體組裝。

圖2：翹起結(jié)構(gòu)（Flap）的兩個(gè)特征：Flap的長度（A）和相鄰Flap的間距（B）

綜上，李晴課題組應(yīng)用電鏡核酸技術(shù)直接觀察復(fù)制叉滯后鏈的分子事件，發(fā)現(xiàn)Pol32介導(dǎo)了核小體組裝，進(jìn)而提供了岡崎片段合成過程中鏈置換的終止位置，為岡崎片段成熟和核小體組裝協(xié)同機(jī)制提供直接證據(jù)（圖3）。

圖3：Pol32介導(dǎo)核小體組裝與岡崎片段成熟協(xié)同機(jī)制。(i) ?Pol δ催化岡崎片段合成；(ii) ?岡崎片段合成后，通過Pol32快速組裝H3-H4四聚體到新合成的DNA上；(iii) ?Pol δ侵入先前產(chǎn)生的具有新生核小體的岡崎片段；(iv) ?岡崎片段合成的重復(fù)循環(huán)，形成反應(yīng)核小體間距的flap間距；在Pol32缺失突變體中，核小體組裝水平下降導(dǎo)致核小體屏障的減少，進(jìn)而導(dǎo)致岡崎片段增長

北京大學(xué)石國君博士、北京大學(xué)博士研究生楊超淇、吳佳樂為論文的共同第一作者。李晴和北京大學(xué)馮建勛副研究員為本文的共同通訊作者。北京大學(xué)雷陽博士和胡家志教授為本文的共同作者。北京大學(xué)孔道春教授對電鏡核酸技術(shù)提供了建議，希望城國家醫(yī)學(xué)中心貝克曼研究所沈炳輝教授參加了本工作的討論，北京大學(xué)電鏡平臺郝雪梅老師和劉軼群老師提供了幫助。本研究得到科技部、國家自然科學(xué)基金委、北京市教育委員會、北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心和蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等資助。

參考文獻(xiàn)：

1.D. J. Smith, I. Whitehouse, Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatin assembly. Nature 483, 434—U480 (2012).

2.N. C. Koussa, D. J. Smith, Post-replicative nick translation occurs on the lagging strand during prolonged depletion of DNA ligase I in. G3-Genes Genom Genet 11 (2021).

來源：北京大學(xué)