中國科學(xué)院上海藥物研究所柳紅團隊與上?？萍即髮W(xué)、清華大學(xué)、中國科學(xué)院武漢病毒研究所、重慶醫(yī)科大學(xué)等的科研人員合作，在國際上首次闡明了猴痘病毒核心蛋白酶（Core^Pro）三維結(jié)構(gòu)，揭示了核心蛋白酶底物識別與催化的分子機制，通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計策略發(fā)現(xiàn)了具有高效酶抑制活性和廣譜抗正痘病毒活性（猴痘病毒和痘苗病毒）的先導(dǎo)化合物，并闡明了其微觀作用機制。這一研究證實了正痘病毒的核心蛋白酶是全新的廣譜抗病毒藥物靶標(biāo)，為靶向核心蛋白酶開發(fā)廣譜高效抗正痘病毒藥物提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和良好的先導(dǎo)化合物。

猴痘病毒屬于正痘病毒屬，該屬還包含天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒3種已知的人畜共患病毒。歷史上，人類與天花病毒斗爭近千年，曾有數(shù)億人因天花病毒感染死亡。當(dāng)前，尚無具有明確療效的抗猴痘病毒藥物。因此，發(fā)現(xiàn)和確證抗猴痘病毒新靶標(biāo)，開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、低毒高效且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗猴痘病毒藥物具有重要意義。

正痘病毒是包膜的雙鏈DNA病毒，復(fù)制過程中會編碼高度保守的核心蛋白酶，核心蛋白酶通過水解核心蛋白前體驅(qū)動感染性成熟顆粒形成，在正痘病毒生命周期中發(fā)揮作用。因此，闡明正痘病毒三維結(jié)構(gòu)和底物識別機制，并基于此開展先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)研究具有重要意義。

該研究解析了猴痘病毒核心蛋白酶的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。核心蛋白酶為二聚體，每個單體可分為N端結(jié)構(gòu)域NTD、催化結(jié)構(gòu)域CD和C端結(jié)構(gòu)域CTD。活性中心位于催化結(jié)構(gòu)域，包含一個特征的催化三聯(lián)體Cys328-His241-Asp258。研究通過高通量篩選策略發(fā)現(xiàn)，泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64d具有潛在的核心蛋白酶抑制效果和抗猴痘病毒活性，但活性較弱。猴痘病毒核心蛋白酶與E64d的復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，其與活性中心附近一個非催化Cys237殘基發(fā)生共價結(jié)合，未能完全占據(jù)底物結(jié)合口袋。

為開發(fā)更強效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制劑，該研究開展了猴痘病毒核心蛋白酶底物識別和催化機制的工作。基于核心蛋白酶天然底物P25K序列，研究利用醛基替換切割斷裂的酰胺鍵設(shè)計了底物類似物I-G18，以期與催化中心Cys328共價結(jié)合，模擬催化中間體的結(jié)構(gòu)特征。研究通過冷凍電鏡技術(shù)，解析了CorePro-I-G18復(fù)合物結(jié)構(gòu)。與apo結(jié)構(gòu)相比，在底物的誘導(dǎo)下，核心蛋白酶活性中心發(fā)生一系列構(gòu)象變化，暴露出催化活性中心，完成底物水解。S1和S2口袋形成特征性的狹長空腔，僅可容納Gly和Ala等側(cè)鏈尺寸較小的氨基酸殘基，解釋了正痘病毒核心蛋白酶Ala-Gly序列識別專一性。

以核心蛋白酶的底物識別機制為基礎(chǔ)，該研究利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計策略設(shè)計合成了擬肽類抑制劑A1-A6，引入P1-P5片段分別占據(jù)核心蛋白酶S1-S5底物結(jié)合口袋，同時在P1位置連接親電彈頭warhead與催化中心Cys328殘基共價結(jié)合?；钚詼y試發(fā)現(xiàn)，A2-A6具有高效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性，其中化合物A3活性最優(yōu)，IC₅₀達(dá)到44.9 nM，較底物衍生的九肽醛I-G18提高7倍。進(jìn)一步，為闡明酶抑制活性的差異，研究解析了A1、A3和A4與核心蛋白酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，3個化合物均可與催化中心的Cys328殘基共價結(jié)合，并能夠較好地占據(jù)底物結(jié)合口袋，其中A3的P4片段F原子能夠與Asp194殘基形成額外氫鍵相互作用，揭示了A3酶抑制活性更優(yōu)的原因?？共《净钚詼y試發(fā)現(xiàn)，化合物A3-A6具備較強的抗猴痘病毒活性和抗痘苗病毒活性，具有廣譜性；同時表現(xiàn)出良好的安全性，CC₅₀均大于200 μM。相較于九肽醛I-G18，擬肽類化合物的抗病毒活性提升。研究表明，A3-A6是良好的先導(dǎo)化合物，有望通過進(jìn)一步成藥性結(jié)構(gòu)優(yōu)化開發(fā)出廣譜抗正痘病毒藥物。

4月22日，相關(guān)研究成果以加速預(yù)覽形式發(fā)表在《自然》（Nature）上。研究工作得到教育部學(xué)科突破先導(dǎo)項目、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項及上海市相關(guān)項目等的支持。

論文鏈接

核心蛋白酶抑制劑的設(shè)計發(fā)現(xiàn)與作用模式研究

來源：中科院