2025年5月5日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院伊成器教授與中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王秀杰研究員合作，在Nature Methods期刊上發(fā)表了題為“Mild and ultrafast GLORI enables absolute quantification of m6A methylome from low-input samples”的研究論文。該研究對(duì)原有的GLORI技術(shù)進(jìn)行了全面升級(jí)，顯著提高了其在痕量RNA樣品中的適用性，為表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究開辟了新的可能性。

N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核生物mRNA內(nèi)部最豐富的化學(xué)修飾，在mRNA的生命周期中扮演著至關(guān)重要的角色，包括可變剪接、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯效率及穩(wěn)定性等。GLORI技術(shù)作為一種重要的m6A測(cè)序方法，能夠利用化學(xué)反應(yīng)將未甲基化的腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，從而實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率下m6A的絕對(duì)定量檢測(cè)。然而，傳統(tǒng)GLORI技術(shù)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的RNA降解，極大地限制了其在低起始量RNA樣本中的應(yīng)用。但在實(shí)際研究中，往往只能獲取有限數(shù)量的細(xì)胞，這使得傳統(tǒng)GLORI方法難以發(fā)揮作用。因此，克服GLORI技術(shù)中的RNA降解問(wèn)題，使其能夠兼容少量樣本，成為亟待解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

針對(duì)這一難題，研究團(tuán)隊(duì)首先深入剖析了GLORI介導(dǎo)的脫氨機(jī)制，優(yōu)化了反應(yīng)條件，成功開發(fā)出新一代技術(shù)——GLORI 2.0。該方法采用溫和、快速、一鍋式的操作流程，能夠有效保持RNA的完整性，適合于較低的RNA起始量（圖1a）。為了進(jìn)一步減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的樣本損失，研究團(tuán)隊(duì)巧妙地設(shè)計(jì)了反轉(zhuǎn)錄沉默載體RNA。這種載體RNA在文庫(kù)制備過(guò)程中能夠被自動(dòng)移除，不會(huì)對(duì)后續(xù)測(cè)序造成干擾。通過(guò)將這種載體RNA整合到GLORI 2.0中，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)出了GLORI 3.0，實(shí)現(xiàn)了從幾百到幾千個(gè)細(xì)胞中生成精準(zhǔn)的定量m6A圖譜（圖1b）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與GLORI 1.0相比，GLORI 2.0在多個(gè)方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)：其一，GLORI 2.0大幅降低了對(duì)RNA輸入量的要求；其二，GLORI 2.0能夠檢測(cè)到更多位于低豐度mRNA上的修飾位點(diǎn)（圖1c）；其三，除了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序外，GLORI 2.0還支持對(duì)特定的m6A修飾位點(diǎn)進(jìn)行低通量檢測(cè)。GLORI 3.0的量化能力與GLORI 2.0相近，但更適用于超低RNA起始量的情況。為了驗(yàn)證GLORI 3.0的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，研究團(tuán)隊(duì)利用該方法對(duì)小鼠海馬突觸和細(xì)胞質(zhì)組分進(jìn)行了m6A定量檢測(cè)，并成功發(fā)現(xiàn)突觸相關(guān)基因（如Slitrk3、Bdnf等）具有較高的修飾水平。

圖1 GLORI 2.0和3.0實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄檢測(cè)m6A修飾（a）優(yōu)化后的化學(xué)反應(yīng)能夠維持RNA完整性；（b）GLORI 3.0整合了反轉(zhuǎn)錄沉默載體RNA；（c）GLORI 2.0表現(xiàn)出更高的檢測(cè)靈敏度

綜上所述，經(jīng)過(guò)全面升級(jí)的GLORI技術(shù)能夠高效應(yīng)用于少量甚至痕量RNA樣品，這對(duì)處理具有挑戰(zhàn)性的樣本（包括來(lái)自復(fù)雜組織的亞細(xì)胞成分、來(lái)自異質(zhì)樣本的稀有細(xì)胞類型和亞型以及稀缺的臨床樣本）具有重要的意義。這些創(chuàng)新性的改進(jìn)顯著提升了GLORI技術(shù)的性能，并極大地拓展了其在表轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中的應(yīng)用范圍。

伊成器、王秀杰為本研究論文的共同通訊作者，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后孫含笑、陸博，中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所博士后張澤宇為論文的共同第一作者。該工作得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

來(lái)源：北京大學(xué)