外泌體能夠在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、mRNA和非編碼RNA等分子，在細(xì)胞間通訊中起著重要作用，是近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。這次，小編要為您分享一篇發(fā)表于《Cell Metabolism》的研究，探索外泌體miRNA在Ⅰ型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用。一起來看看高分文章的研究策略與方法吧！

研 究 背 景

Ⅰ型糖尿病是一種自身免疫性疾病，具有獨(dú)特的分子病理特征，例如免疫細(xì)胞浸潤胰島，以及選擇性地清除胰島β細(xì)胞?；加孝裥吞悄虿〉幕颊弑仨毥K身使用胰島素，給生活造成極大不便。因此，為了尋找新型治療策略、預(yù)防疾病發(fā)展，了解胰島β細(xì)胞與浸潤性免疫細(xì)胞之間的相互作用至關(guān)重要。來自美國的研究人員發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞能夠通過釋放含有miR-142-3p、miR-142-5p和miR-155的外泌體作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)β細(xì)胞凋亡。這可能是Ⅰ型糖尿病產(chǎn)生發(fā)展機(jī)制的一部分。
首先來了解一下外泌體miRNA的研究策略
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下面小編就來逐步分析，看看研究人員是如何基于上述策略，得出激動人心的研究成果的？

1.目的基因篩選

先前，研究者已使用基因芯片分析了4周齡與8周齡的NOD小鼠（Ⅰ型糖尿病動物模型）胰島細(xì)胞的miRNA全表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，miR-142-3p/-5p、miR-150與miR-155的表達(dá)量顯著失調(diào)。這些miRNA能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活動，但在胰島細(xì)胞中的表達(dá)量通常很低。本研究中，研究人員使用流式細(xì)胞儀分選出糖尿病前期NOD小鼠的胰島β細(xì)胞后進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞中，miR-142-3p/-5p與miR-155的表達(dá)顯著上調(diào)（下圖）。
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圖1 糖尿病前期NOD小鼠的胰島β細(xì)胞中，miR-142-3p/-5p與miR-155的表達(dá)顯著上調(diào)
免疫細(xì)胞對β細(xì)胞的部分有害作用是通過釋放促炎癥細(xì)胞因子實現(xiàn)的，因此，研究者同時嘗試將小鼠胰島細(xì)胞暴露在促炎癥細(xì)胞因子中，但并未觀察到miRNA的水平變化，說明上述miRNA水平的增加并非由促炎癥細(xì)胞因子引起。

2.外泌體分離與RNA鑒定

鑒于免疫細(xì)胞釋放大量的外泌體，研究者猜測胰島細(xì)胞內(nèi)miR-142-3p/-5p與miR-155的水平出現(xiàn)增長是由外泌體引起。為了驗證該假設(shè)，研究者使用超速離心富集來自人類Jurkat細(xì)胞（一種人T淋巴細(xì)胞系）的外泌體（exoT）與來自NOD小鼠T淋巴細(xì)胞的外泌體（exoNOD），并利用電鏡觀察、粒徑分析與特征蛋白分析等方式鑒定其外泌體特征（下圖）。
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圖2 exoT與exoNOD的特征鑒定（A&B：電鏡照片；C：外泌體特異性蛋白鑒定；D&E：外泌體粒徑分析）
接下來，研究者使用qPCR驗證上述外泌體中的miRNA含量，發(fā)現(xiàn)這些T淋巴細(xì)胞釋放的外泌體中均存在miR-142-3p/-5p、miR-155。為了驗證這些miRNA確實能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至胰島β細(xì)胞，研究者將小鼠胰島細(xì)胞與exoNOD共同孵育72小時，隨后用qPCR檢測胰島細(xì)胞內(nèi)的miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miR-142-3p/-5p與miR-155水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)（下圖左）。為了進(jìn)一步驗證增加的miRNA是否來源于外泌體，研究人員借助于人類miR-155與嚙齒動物的miR-155之間一個堿基的差異，將來自人類T淋巴細(xì)胞系的外泌體exoT與大鼠的胰島細(xì)胞共同孵育，隨后使用物種特異性qPCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)大鼠胰島細(xì)胞內(nèi)增加的miR-155完全來源于人類T細(xì)胞外泌體，而非內(nèi)源性合成的mmu-miR-155（下圖中、右）。
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圖3 胰島細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的miRNA來源于外泌體
為了驗證miR-155是否以活性形式轉(zhuǎn)運(yùn)入β細(xì)胞，研究者構(gòu)建了熒光素酶報告系統(tǒng)。將轉(zhuǎn)染了針對miR-155的熒光素酶報告系統(tǒng)的鼠胰島細(xì)胞系MIN6B1與exoT共同孵育48或72小時后，觀察到熒光素酶活性降低（下圖），證明miR-155是以活性形式轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。
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圖4 熒光素酶報告系統(tǒng)顯示miR-155以活性形式轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞

3.miRNA功能研究

細(xì)胞凋亡試驗
將大鼠胰島細(xì)胞與exoT共同孵育，胰島細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的細(xì)胞凋亡，這種凋亡可以被pan-caspase抑制劑zVAD抑制（下圖上）。將人胰島細(xì)胞與人血清中T細(xì)胞釋放的外泌體（exo-hT）共同孵育，同樣觀察到miR-142-3p/-5p、miR-155水平上升，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加（下圖下）。
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圖5?外泌體引發(fā)胰島細(xì)胞凋亡
接下來，研究者使用miRNA mimic分別直接增加大鼠胰島細(xì)胞內(nèi)的miR-142-3p/-5p與miR-155水平，發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡（下圖上）。隨后，研究者使用anti-miR嘗試阻止被轉(zhuǎn)運(yùn)的miRNA發(fā)揮作用。anti-miR不影響外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA，但在miRNA進(jìn)入胰島細(xì)胞后，anti-miR能夠捕獲miRNA，阻止其發(fā)揮作用。與預(yù)期相符，胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)染入anti-miR后，對exoT引起的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了抵抗效應(yīng)（下圖下）。
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圖6?miRNA效應(yīng)蛋白篩選

4.miRNA作用機(jī)理研究

（1）靶基因篩選
為了探索T細(xì)胞外泌體引發(fā)β細(xì)胞凋亡的機(jī)制，研究者對經(jīng)exoNOD處理的小鼠胰島細(xì)胞進(jìn)行了RNA表達(dá)譜與信號通路分析。結(jié)果顯示，與細(xì)胞因子（cytokine）和細(xì)胞趨化因子（chemokine）信號通路相關(guān)的蛋白水平出現(xiàn)上調(diào)，包括Ccl2，Ccl7和Cxcl10（下圖）。研究同時嘗試了在小鼠胰島細(xì)胞中直接過表達(dá)miR-142-3p/-5p與miR-155，以及將人類胰島細(xì)胞與人類T細(xì)胞外泌體exo-hT共同孵育，均同樣觀察到Ccl2，Ccl7和Cxcl10水平上調(diào)。
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圖7?miRNA效應(yīng)蛋白篩選
（2）信號通路鑒定
人們已經(jīng)知道，激活NF-κB信號通路可導(dǎo)致Ccl2，Ccl7和Cxcl10等蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生變化，同時，NF-κB能夠啟動胰島β細(xì)胞凋亡。為了驗證T淋巴細(xì)胞外泌體是否激活了胰島細(xì)胞的NF-κB信號通路，研究者將鼠胰島細(xì)胞系MIN6B1與exoT共同孵育，觀察到NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（下圖左），說明該因子被激活。向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-142-3p/-5p與miR-155 mimics后，觀察到同樣的轉(zhuǎn)定位效應(yīng)（下圖右）。值得一提的是，實驗中轉(zhuǎn)定位的NF-κB相對于未轉(zhuǎn)移蛋白的比例，與細(xì)胞暴露在促炎癥細(xì)胞因子后產(chǎn)生的效應(yīng)極為相似（下圖中）。
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圖8?NF-κB的轉(zhuǎn)定位效應(yīng)

5.動物實驗驗證

上述研究提示，在Ⅰ型糖尿病早期，免疫細(xì)胞浸潤胰島β細(xì)胞時，一組從免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至β細(xì)胞的miRNA可能對疾病發(fā)展具有影響。為了在動物體內(nèi)驗證上述假設(shè)，研究者基于腺病毒載體構(gòu)建了一個包含胰島素啟動子、GFP與miR-142-3p/-5p、miR-150、miR-155結(jié)合位點的“miRNA海綿”（下圖左）。將該載體腹腔注射入8周齡的NOD小鼠體內(nèi)后，觀察到載體依照預(yù)期特異性表達(dá)于胰島β細(xì)胞內(nèi)。至32周齡時，未注射載體的對照組NOD小鼠中，80%患上了糖尿病，而接受了“miRNA海綿”注射的NOD小鼠中僅有40%患?。ㄏ聢D右）。
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圖9 左：“miRNA海綿”結(jié)構(gòu)示意? 右：實驗組與對照組生存曲線
組織學(xué)分析顯示，相比患病小鼠，未患病的小鼠體內(nèi)胰島素含量更高，并且具有更低的胰島炎癥評分。另外，與體外實驗結(jié)果一致，未患病小鼠胰島細(xì)胞中的Cxcl10表達(dá)量較低（下圖左）。Cxcl10表達(dá)量降低甚至從小鼠8周齡時已開始出現(xiàn)（下圖右）。
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圖10?未患病小鼠胰島細(xì)胞中的Cxcl10表達(dá)量較低（Sp-Np：患病小鼠；Sp-prot：未患病小鼠；紅色熒光：Cxcl10；綠色熒光：胰島素）
未患病小鼠胰島細(xì)胞中的Cxcl10表達(dá)量較低（Sp-Np：患病小鼠；Sp-prot：未患病小鼠；紅色熒光：Cxcl10；綠色熒光：胰島素）
參考文獻(xiàn)：Guay C, Kruit JK,?et al.?Lymphocyte-Derived Exosomal MicroRNAs Promote Pancreatic β Cell Death and May Contribute to Type 1 Diabetes Development[J].?Cell Metab, 2018 Oct 5. doi: 10.1016/j.cmet.2018.09.011.
來源：銳博生物
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