熒光肌營養(yǎng)不良小鼠點燃潛在的反義寡核苷酸藥物-肽度TIMEDOO
馬薩諸塞州綜合醫(yī)院（MGH）的研究人員開發(fā)了一種最常見肌營養(yǎng)不良癥——強直性肌營養(yǎng)不良I型（DM1）的熒光小鼠模型，這可能有助于科學(xué)家找到治療這種遺傳性疾病的新方法。該研究團隊使用基因工程小鼠進行的初步研究已經(jīng)表明，反義寡核苷酸(ASO)的修飾形式能夠靶向并糾正DM1導(dǎo)致的異常RNA剪接。在這種小鼠中，骨骼肌蛋白可根據(jù)是否成功治療而發(fā)出不同顏色的熒光。
熒光肌營養(yǎng)不良小鼠點燃潛在的反義寡核苷酸藥物-肽度TIMEDOO
“這種新型熒光模型可以簡單地通過使用攝像機拍攝活體小鼠的照片來監(jiān)測治療藥物活性，”該研究負責人MGH神經(jīng)科和哈佛醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)助理教授Thurman Wheeler博士表示。相關(guān)研究成果于2018年12月7日以題為“Non-invasive monitoring of alternative splicing outcome to identify candidate therapies for myotonic dystrophy type 1”發(fā)表在Nature Communications上。
肌營養(yǎng)不良是一組導(dǎo)致進行性肌肉無力和消瘦的遺傳性疾病，作者解釋道。肌強直性營養(yǎng)不良（DM）是成人中最常見的肌營養(yǎng)不良疾病，7500人中就有1人受到影響。該疾病是由DM蛋白激酶（DMPK）基因中的CTG重復(fù)擴增（CTGexp）引起的，但是目前還沒有可以改變疾病進程的治療方法。DM具有兩種亞型，其中DM1影響RNA剪接。DM1相關(guān)突變影響骨骼肌中多種蛋白質(zhì)的剪接，以及參與胰島素代謝和心臟功能的蛋白質(zhì)。研究人員表示，突變型DMPK-CUGexp mRNA在肌肉中的表達會導(dǎo)致肌強直（肌纖維收縮延遲松弛）、組織病理性肌病和進行性肌肉消瘦。
目前急需針對肌營養(yǎng)不良癥的新療法和更好的實驗工具來幫助尋找新療法，但存在的一個關(guān)鍵障礙是缺乏適當?shù)膭游锬Ｐ蛠碓u估新的候選藥物。“目前測量藥物活性的方法涉及肌肉組織的生化分析，這種方法既昂貴又耗時，并且可能需要大量動物才能達到必要的統(tǒng)計功效，”該研究團隊評論道。
Wheeler博士研究團隊現(xiàn)在利用了一種用于細胞研究的基于熒光蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，將其應(yīng)用于活體動物身上，點亮骨骼肌組織蛋白質(zhì)。在DM1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，受異常RNA剪接影響的骨骼肌組織纖維發(fā)出熒光綠色，而那些糾正剪接的骨骼肌組織纖維則發(fā)出紅色熒光。“通過將已確定的強直性肌營養(yǎng)不良I型小鼠模型（取決于靶RNA序列的剪接）與在肌肉中表達紅色或綠色熒光蛋白的小鼠模型進行雜交，我們開發(fā)了一種模型，在接受治療前肌肉呈綠色，治療成功后則轉(zhuǎn)變呈紅色，“Wheeler博士指出。
熒光肌營養(yǎng)不良小鼠點燃潛在的反義寡核苷酸藥物-肽度TIMEDOO
TR;HSALR bi-transgenic mice as a therapy reporter model for DM1
通過檢測候選藥物治療后動物肌肉中紅色和綠色熒光之間的比率，表明該藥物在糾正異常剪接方面的有效性。該研究團隊還開發(fā)了一種基于激光激發(fā)的熒光光譜系統(tǒng)，用于可視化熒光信號。
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該研究團隊首先使用一種靶向異常剪接事件的現(xiàn)有反義寡核苷酸（ASO）來測試他們的模型。ASOs是一類經(jīng)修飾過的，能與RNA結(jié)合的核酸分子?！霸贒M1轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過ASOs靶向RNA介導(dǎo)的疾病過程可以逆轉(zhuǎn)RNA錯誤剪接，消除肌強直，減緩肌病進展……”作者解釋道。在將ASO注入肌肉后，紅/綠比率在三天內(nèi)開始增加，并持續(xù)數(shù)周。49天后的肌肉組織分析證實，治療已糾正了異常的RNA剪接。第二組測試通過皮下注射不同的ASO用于糾正原始DM1小鼠模型中的RNA剪接，也產(chǎn)生了治療效果，紅/綠比率在第一次注射后14天內(nèi)增加，并隨著后續(xù)劑量繼續(xù)增加。
熒光肌營養(yǎng)不良小鼠點燃潛在的反義寡核苷酸藥物-肽度TIMEDOO
Imaging therapeutic antisense oligonucleotide drug activity in vivo
ASOs并不是治療DM1的理想選擇，作者指出。盡管它們對骨骼肌有效，但“藥物活性不如在其他組織中（如肝臟）強，這可能是由于組織生物利用度差和藥效不足所致。”另一種方法是使用配體共軛反義(LICA)技術(shù)，將軛合物添加到ASOs中以增加藥物攝取。該研究團隊在小鼠模型中測試了LICA修飾的ASO，以確定它是否可以在骨骼肌中起作用，并確定使用非共軛ASO進行過度治療是否有任何益處。
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In vivo comparison of LICA and the unconjugated parent ASO
LICA ASO開始顯示治療活性的速度是非共軛ASO的兩倍，并且在一半劑量下有效，“這表明它的效力至少是非共軛ASO的兩倍，”研究人員表示。“我們的數(shù)據(jù)支持進一步開發(fā)LICA技術(shù)，用于治療DM1和其他靶向骨骼肌的ASO應(yīng)用，”他們總結(jié)道?！?strong>該模型可用于快速鑒定候選療法，以降低DM1中CUGexp轉(zhuǎn)錄本的致病性，包括新的ASO化學(xué)和軛合物、小分子、短干擾RNA（siRNA）、用于產(chǎn)生反義RNAs的基因治療載體、挽救異常剪接的基于蛋白質(zhì)的療法、以及減少基因組CTG重復(fù)長度或抑制CUGexp重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄的基因編輯方法。“
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LICA oligonucleotide treatment effects
“我們的研究結(jié)果支持LICA技術(shù)進一步開發(fā)用于治療DM1。除了新的ASOs，其他治療策略，如小分子候選藥物、siRNAs和基于蛋白質(zhì)的療法也可以使用該模型進行測試，“Wheeler博士說?！?strong>從長遠來看，它將成為測試基因編輯治療方法的理想選擇，因為它們已經(jīng)具有很好的使用價值?？焖侔l(fā)現(xiàn)有希望的治療方法和盡早拋棄失敗的候選方法將有助于使患者更快地獲得有效的治療，并且開發(fā)成本更低。“
文章來源于：https://www.genengnews.com/news/fluorescent-muscular-dystrophy-mouse-lights-up-potential-antisense-oligo-drugs/

參考文獻：

Hu N, Antoury L, Baran T M, et al. Non-invasive monitoring of alternative splicing outcomes to identify candidate therapies for myotonic dystrophy type 1[J].?Nature Communications, 2018, 9(1): 5227.

來源：銳博生物

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