杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程科學(xué)家研發(fā)出一種新方法，可以將CRISPR基因組編輯技術(shù)的準(zhǔn)確性平均提高50倍，他們相信這種技術(shù)將能很快應(yīng)用到多種編輯技術(shù)上。

具體來說，這種方法就是在導(dǎo)向RNA上添加一段短“尾巴”，這種“尾巴”會向后折疊，與其自身結(jié)合，形成一個“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，只有靶向DNA序列能解開。

這一研究成果公布在4月15日的Nature Biotechnology雜志上。

多個CRISPR系統(tǒng)都會產(chǎn)生不必要的遺傳編輯

“一般來說，CRISPR準(zhǔn)確性高，但已經(jīng)有了一些例子出現(xiàn)了脫靶效應(yīng)，因此這個研究領(lǐng)域?qū)τ谔岣咛禺愋云毡殛P(guān)注。但到目前為止提出的解決方案都不能在不同的CRISPR系統(tǒng)之間輕松轉(zhuǎn)換”，文章作者，杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach說。

CRISPR-Cas9是一種防御系統(tǒng)，細(xì)菌用它來靶向和切割入侵病毒的DNA。雖然第一個被設(shè)計用于人體細(xì)胞的CRISPR技術(shù)源自Streptococcus pyogenes這種細(xì)菌，但其它細(xì)菌也具有其它的形式。

一直以來，科學(xué)家們花費(fèi)了大量時間，找到了特殊的新CRISPR系統(tǒng)，不斷添加到CRISPR庫中。例如，一些系統(tǒng)較小，適合病毒載體遞送至人體細(xì)胞用于基因治療。但無論這些系統(tǒng)的功能如何，都會產(chǎn)生不必要的遺傳編輯。

CRISPR系統(tǒng)的一個共同特性是利用RNA分子作為指導(dǎo)，一旦導(dǎo)向RNA找到其互補(bǔ)的基因序列，Cas9酶就像剪刀一樣在DNA中切割，促進(jìn)基因組序列的改變。但是因為每個序列只有20個核苷酸長，而人類基因組含有大約30億個堿基對，所以搜尋過程漫長，而且CRISPR有時會出現(xiàn)錯誤，對上了錯誤的堿基對。

提高CRISPR準(zhǔn)確性的一種方法是兩個Cas9分子結(jié)合到相同DNA序列的相對鏈上，完成完全切割。雖然這種方法有效，但它會給系統(tǒng)增加更多部件，增加復(fù)雜性，難以實現(xiàn)。

另一種方法是對Cas9蛋白進(jìn)行基因工程改造，使其功效降低，從而更少的犯錯誤，但是要構(gòu)建這樣的蛋白并不容易，同時對于不同的CRISPR系統(tǒng)，需要不同的蛋白工程設(shè)計。

導(dǎo)向RNA的設(shè)計

“現(xiàn)在似乎每周都會發(fā)現(xiàn)一種新的CRISPR系統(tǒng)，它們具有獨(dú)特的性質(zhì)，在特定的應(yīng)用中非常有效，”Gersbach說，“每當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)新的CRISPR蛋白，進(jìn)行廣泛的重新設(shè)計并不是一個容易實現(xiàn)的解決方法?！?/p>

“我們希望能研發(fā)出對于任何類型的CRISPR系統(tǒng)都是通用的方法，”博士生Dewran Kocak說，“所有CRISPR系統(tǒng)的共同點(diǎn)是都需要導(dǎo)向RNA，這些短RNA更易于設(shè)計?！?/p>

研究人員提出了新的解決方案：將導(dǎo)向RNA延伸多20個核苷酸，讓其自身折疊，變成原始導(dǎo)向RNA的“尾巴”，形成發(fā)夾形狀。如果DNA序列中有一個堿基不正確，這就會形成一種無法解開的鎖定，而由于導(dǎo)向RNA更傾向于與DNA結(jié)合，因此碰到正確組合的DNA，就能打開，靶向結(jié)合。

“我們能夠?qū)@種‘鎖定’的強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)，方便導(dǎo)向RNA在達(dá)到正確匹配時仍能正常工作，”Kocak說。

研究人員表示，這種方法可以將四種不同細(xì)菌菌株的五種不同CRISPR系統(tǒng)的編輯準(zhǔn)確率（人體細(xì)胞切割的準(zhǔn)確性）平均提高50倍。在其中一個案例中，甚至提高了200多倍。

“這是一個非常簡單的想法，Dewran多年來的工作表明它的工作方式與我們認(rèn)為的相符，這是一個很好的解決方案，可以擺脫脫靶效應(yīng)?！?/p>

下一步，研究人員希望能夠看到這種方法應(yīng)用于多少種不同的CRISPR變體，并且深入探索鎖定機(jī)制的工作原理，CRISPR變體之間是否存在差異等。由于這些實驗是在培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行的，研究人員也迫切希望看到這種方法在實際動物疾病模型中是否能提高CRISPR的準(zhǔn)確性。

來源：生物通

原文標(biāo)題：

Increasing the Specificity of CRISPR Systems with Engineered RNA Secondary Structures