隨著新一代測序的出現(xiàn)，各種生物的遺傳數(shù)據(jù)呈指數(shù)級增長，但了解基因的序列數(shù)據(jù)，這顯然還不夠。為了讓遺傳數(shù)據(jù)真正派上用場，必須確定基因功能，并了解基因型與表型之間的關聯(lián)。功能基因組學就旨在闡明基因型與表型之間的關系。

經(jīng)典的方法是正向遺傳篩選，也就是對基因功能進行修飾，并確定表型的變化。過去，正向篩選主要是依靠隨機突變和病毒轉座子來改變基因功能，但這些方法難以大規(guī)模開展。RNAi的出現(xiàn)讓研究人員能夠?qū)蚬δ荛_展靶向破壞。

過去十幾年，RNAi一直是功能基因組學篩選的首選方法，但橫空出世的CRISPR-Cas9似乎搶了RNAi的不少風頭。在這里，我們就來比較一下RNAi和CRISPR-Cas9在篩選基因功能上的應用。

RNAi帶來的基因沉默

人們早就觀察到將雙鏈RNA（dsRNA）引入生物體會引起基因沉默，但直到1998年Fire和Mello發(fā)表線蟲的研究成果，這個機制才變得清晰，也有了RNA干擾（RNAi）這個術語。RNAi通過小分子RNA來調(diào)控基因表達，在細胞發(fā)育和免疫中起重要作用。

雙鏈RNA分子在內(nèi)源蛋白DICER和RISC的加工下成為單鏈RNA，靶向與其互補的mRNA轉錄本并使其降解，導致轉錄后的蛋白質(zhì)水平降低。除了外源RNA，其他RNA分子也可以引發(fā)基因沉默，包括siRNA、miRNA和shRNA。

之后，RNAi被迅速用于各種細胞和生物體，一躍成為基因改造的首選方法。它僅需要短的干擾RNA（siRNA），就能引發(fā)基因功能的快速喪失。不過，利用siRNA來進行全基因組篩選就比較麻煩，需要一個一個來評估。

于是，人們利用慢病毒載體將shRNA文庫導入細胞。shRNA隨機整合到基因組中，并穩(wěn)定表達，從而克服了siRNA的限制。這種方法讓每個細胞帶上“條形碼”，實現(xiàn)了混合形式的全基因組shRNA文庫篩選。它后來也應用到CRISPR-Cas9篩選中。

CRISPR-Cas9需要將Cas9和sgRNA一起導入，而RNAi的機制在大多數(shù)哺乳動物細胞中是保守的，這是它的主要優(yōu)點。轉染siRNA仍然是最快速最簡單的方法，能夠迅速引起表型變化。不過對于高通量的表型篩選而言，混合文庫更有吸引力，并且更經(jīng)濟。

惱人的脫靶效應

RNAi和CRISPR-Cas9都有脫靶效應的風險，可能導致假陽性，因為shRNA或sgRNA可靶向帶有互補種子區(qū)的序列，造成依賴序列的脫靶效應。RNAi同時還表現(xiàn)出不依賴序列的脫靶活性，導致干擾素調(diào)節(jié)基因的上調(diào)和蛋白質(zhì)表達的改變。脫靶造成的基因沉默使人們很難鑒定和驗證hits，對功能基因組篩選是不利的。

為了避免RNAi的序列依賴性脫靶效應，人們通過生物信息學工具來精心挑選shRNA序列，并采用多個獨立的shRNA來靶向同一基因，以此來提高統(tǒng)計學顯著性。目前，基于RNAi的正向篩選已經(jīng)獲得了可靠的數(shù)據(jù)集，但負向篩選仍受到高背景噪音的干擾。

在CRISPR-Cas9技術的早期也觀察到序列依賴性脫靶活性，以及sgRNA效率的差異。不過，設計工具的改進在很大程度上減輕了這些的影響。如今，你可以借助多種算法來選擇最高效、最特異的向?qū)NA庫。與shRNA一樣，選擇多個sgRNA來靶向目的基因，可確認結果具有統(tǒng)計學意義。不過最近的一項研究表明，CRISPR-Cas9的脫靶效應要低于RNAi。

knockdown vs. knockout

RNAi和CRISPR-Cas9之間的主要區(qū)別在于RNAi是通過靶向RNA，在轉錄后水平降低或敲低基因表達；CRISPR-Cas9則是一種基因編輯工具，靶向DNA并永久改變或敲除基因表達。這兩個選項都很有用，具體要取決于實驗設計和待解決的問題。

某些情況下可能需要CRISPR-Cas9來完全敲除，以免殘留的低水平蛋白表達造成任何不確定的影響。對于具有多個基因拷貝的癌細胞系，它就很有用。當然，在某些情況下敲低是更好的選擇。例如，必需基因的敲除是致死的，導致細胞難以研究。敲低則可以更好地模擬藥物對靶點的抑制。

隨著CRISPR-Cas9工具箱的擴大，人們的選擇不僅僅限于CRISPR-Cas9和RNAi。將催化失活的Cas9（dCas9）與轉錄抑制因子相連接，現(xiàn)在也可以實現(xiàn)CRISPR介導的敲低。CRISPR干擾篩選（CRISPRi）將RNAi的敲低功能與CRISPR的高效特異相結合，應用于功能基因組篩選。

shRNA vs. sgRNA

CRISPR-Cas9技術的快速發(fā)展，遞送載體和sgRNA設計的改進，以及CRISPR衍生技術的出現(xiàn)（包括CRISPRi、CRISPRa、堿基編輯、表觀基因組編輯）將人們從RNAi中吸引過來。CRISPR基因敲除的效率以及高特異性和低背景，與RNAi形成了鮮明對比。RNAi的優(yōu)勢在于依靠內(nèi)源性RNA沉默機制，因此在操作上是最簡單的方法。

如今，多功能的CRISPR技術讓一系列的基因修飾（CRISPR-KO、CRISPRi和CRISPRa）得以實現(xiàn)。因此，它已取代RNAi成為首選的功能基因組篩選工具。

來源：生物通