現(xiàn)階段，科學(xué)家們已經(jīng)開始以單細(xì)胞分辨率組合多層信息。這些“多組學(xué)”技術(shù)可以更仔細(xì)地觀察細(xì)胞之間的可變性，更清楚地識(shí)別特定細(xì)胞及其功能。分析基因組DNA揭示了單細(xì)胞基因組，甲基化組織或染色質(zhì)，而分析RNA和蛋白質(zhì)則能分別產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。

表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組

分析細(xì)胞表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)可以揭示甲基化和染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility，生物通注）對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

“在腫瘤發(fā)生等復(fù)雜的生物過(guò)程中，異質(zhì)性同時(shí)存在于基因組，表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組中，單獨(dú)分析它們可能不起作用，”北京大學(xué)分子生物學(xué)家湯富酬教授說(shuō)?；蛳嗤哪[瘤細(xì)胞可能具有不同的DNA甲基化或基因表達(dá)模式，可能需要多組學(xué)技術(shù)才能明確地將它們分類為亞群。

scM＆T-seq（simultaneous single-cell methylome and transcriptome sequencing）能同時(shí)完成單細(xì)胞甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[1]，這種方法基于G＆T-seq，采用相同的方法從單個(gè)細(xì)胞中分離DNA和RNA，并擴(kuò)增和測(cè)序RNA。對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，然后擴(kuò)增并測(cè)序以測(cè)定甲基化組。

研發(fā)技術(shù)人員表示，“這一新的實(shí)驗(yàn)方案讓你可以并行分析同一單細(xì)胞中的DNA甲基化和RNA。我們的方法提供了有關(guān)單細(xì)胞DNA甲基化異質(zhì)性與特定基因表達(dá)差異之間關(guān)系的首個(gè)直觀視圖。”（Nature Methods：突破性單細(xì)胞表觀基因組與轉(zhuǎn)錄組分析新技術(shù)）

scNMT-seq（single-cell nucleosome, methylation, and transcription sequencing）則是在scM和T-seq基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的[2]，不過(guò)這種技術(shù)需要將單細(xì)胞分離出來(lái)，進(jìn)行處理，檢測(cè)全基因組染色質(zhì)可接近性。不同基因組位置的可接近性，或者保護(hù)性會(huì)影響基因表達(dá)，使用scNMT-seq可以發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞中表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組之間的新關(guān)聯(lián)。

scMT-seq（another method of simultaneously sequencing single cells’ methylomes and transcriptomes）是同時(shí)測(cè)序單細(xì)胞的甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的另一種方法[3]，這種是加州大學(xué)范國(guó)平教授和同濟(jì)大學(xué)薛志剛教授研發(fā)的，他們利用這種方法對(duì)感覺神經(jīng)元進(jìn)行研究，揭示了細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性。不過(guò)，這些差異大多不是啟動(dòng)子甲基化造成的。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子帶CpG島的基因，表達(dá)水平與基因體甲基化正相關(guān)。這項(xiàng)研究表明，scMT-seq可以用來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息，進(jìn)而解析表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制。（同濟(jì)大學(xué)發(fā)布單細(xì)胞測(cè)序新技術(shù)）

scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing是一種單細(xì)胞三重組學(xué)測(cè)序方法[4]，由北京大學(xué)湯富酬教授等人研發(fā)，這種全新的單細(xì)胞三重組學(xué)測(cè)序方法在國(guó)際上首次從同一個(gè)單細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)三種組學(xué)高通量測(cè)序信息的同時(shí)獲取，并從單細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞在三種組學(xué)上存在密切相互關(guān)聯(lián)的高度異質(zhì)性。

scTrio-seq選擇性裂解細(xì)胞膜，將細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與完整細(xì)胞核中的基因組DNA分開。對(duì)于scMT-seq，實(shí)驗(yàn)人員是利用微量移液管收集細(xì)胞核，而在scTrio-seq中，則是通過(guò)離心分離細(xì)胞核。兩種情況中，基因組DNA都是進(jìn)行的改良亞硫酸鹽處理和測(cè)序方法來(lái)檢測(cè)甲基化組，而來(lái)自細(xì)胞裂解物的mRNA則是平行擴(kuò)增和測(cè)序。

“基本上在基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間沒有交叉污染，”湯教授表示。scTrio-seq使用甲基化組序列數(shù)據(jù)計(jì)算評(píng)估基因組拷貝數(shù)變異，這種技術(shù)已用于分析人結(jié)直腸癌樣本中的異質(zhì)性。

蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組

還有幾種技術(shù)可以同時(shí)測(cè)定來(lái)自單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)。這些方法為科學(xué)家提供了轉(zhuǎn)錄后的研究，分析導(dǎo)致蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平之間的差異。

PLAYR（proximity ligation assay for RNA）技術(shù)中，蛋白質(zhì)被不同金屬同位素的抗體標(biāo)記。同時(shí)，RNA轉(zhuǎn)錄物被同位素標(biāo)記的探針結(jié)合。利用一種稱為質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry）的方法測(cè)量同位素，并且這種技術(shù)也可以同時(shí)檢測(cè)每秒數(shù)千個(gè)單細(xì)胞中的40多種不同的mRNA和蛋白質(zhì)。

CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing）采用寡核苷酸標(biāo)記的抗體靶向細(xì)胞表面蛋白。這種技術(shù)分離并裂解單個(gè)細(xì)胞，并將它們的mRNA和寡標(biāo)記抗體與涂有短寡核苷酸序列的磁珠結(jié)合。擴(kuò)增RNA和抗體標(biāo)簽并按大小分離，通過(guò)測(cè)序定量分析蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物。CITE-seq還可同時(shí)檢測(cè)約100種蛋白質(zhì)以及數(shù)萬(wàn)種RNA轉(zhuǎn)錄物。

Marlon Stoeckius是紐約基因組中心的分子生物學(xué)家，他是這項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)者。目前Stoeckius正致力于將該方法擴(kuò)展到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，不過(guò)這需要固定和透化細(xì)胞，這可能會(huì)降低RNA質(zhì)量或?qū)е缕鋸募?xì)胞中滲出。

REAP-seq（RNA expression and protein sequencing assay）類似于CITE-seq，采用寡核苷酸交聯(lián)抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物水平（基于測(cè)序）。

REAP-seq和CITE-seq都可以檢測(cè)很多的轉(zhuǎn)錄本，但與PLAYR相比，每次檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量更少。

“我認(rèn)為它們是互補(bǔ)的方法，”PLAYR的首席開發(fā)人員Gherardini說(shuō)，“如果你有一個(gè)大的隊(duì)列或臨床研究，像PLAYR這樣的東西會(huì)更加經(jīng)濟(jì)有效”。

CITE-seq還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是蛋白質(zhì)定量可以在通常單細(xì)胞RNA測(cè)序制備中丟棄的部分進(jìn)行，因此“對(duì)RNA測(cè)序文庫(kù)的質(zhì)量沒有任何損害，”紐約基因組中心的Peter Smibert說(shuō)，“我們認(rèn)為如果采用RNA-seq作為讀數(shù)，那么就可以使用CITE-seq?！?/p>

參考文獻(xiàn)：

1.Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity

2.scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells

3.Simultaneous profiling of transcriptome and DNA methylome from a single cell

4.Single-cell triple omics sequencing reveals genetic, epigenetic, and transcriptomic heterogeneity in hepatocellular carcinomas

來(lái)源：生物通