被全世界罵了三年的韓春雨，默默發(fā)表了新論文，發(fā)明RNA成像系統(tǒng)

6年前發(fā)布在 7X24h 資訊

近日，韓春雨在預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv發(fā)表了一篇關(guān)于基因編輯的新論文：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE.

該研究開發(fā)了一種新型的活細(xì)胞RNA追蹤成像工具——VN-dCasE-VC，效果和可用性更強(qiáng)。

該論文署名單位為河北科技大學(xué)基因編輯研究中心，通訊作者為韓春雨，第一作者為高峰。

前情回顧

2016年5月2日，韓春雨（河北科技大學(xué)）作為通訊作者在國際頂級學(xué)術(shù)期刊 Nature Biotechnology 雜志發(fā)表了題為：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute（使用NgAgo進(jìn)行DNA引導(dǎo)的基因組編輯）的研究論文。

該研究稱NgAgo對真核生物（包括人）具有基因編輯能力。該研究成功很快在世界范圍內(nèi)爆火，韓春雨老師此前籍籍無名，幾乎一夜之間成為學(xué)術(shù)界網(wǎng)紅，被贊譽(yù)為“在三流學(xué)校取得世界一流原創(chuàng)成果，打破國際基因編輯技術(shù)壟斷”。

該論文通訊作者為韓春雨，第一作者為高峰，浙江大學(xué)教授沈嘯為共同通訊作者，但在后續(xù)修改版本中，沈嘯從作者名單中去除了。

2016年8月，河北科技大學(xué)成立基因編輯研究中心，計劃投入資金逾2億元。但NgAgo的研究成果引發(fā)廣泛質(zhì)疑，2017年8月3日，韓春雨撤回該論文。2018年8月31日，河北科技大學(xué)取消了韓春雨所獲得的榮譽(yù)稱號，終止了韓春雨團(tuán)隊承擔(dān)的科研項目并收回了科研經(jīng)費(fèi)，收回了韓春雨團(tuán)隊所獲校科研績效獎勵。

2019年4月4日，預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv刊登了一篇來自美國普渡大學(xué)研究人員的研究論文，表明NgAgo通過核酸內(nèi)切酶活性介導(dǎo)增強(qiáng)大腸桿菌的同源重組。BioWorld第一時間解讀并報道了該論文，該研究表明NgAgo可以編輯原核生物，但不能編輯真核生物基因組。

韓春雨最新論文的解讀

CasE是Ⅰ-E型 CRISPR復(fù)合物的核心成分，它通過結(jié)合特定的莖環(huán)區(qū)域單獨(dú)處理pre-crRNA，稱之為 CasE Binding S，簡稱為CBS。CasE保守His20參與催化活性，ΔHis26-TtCse3突變的CasE（dCasE）則失去了催化活性，但仍然與其靶標(biāo)緊密結(jié)合。

在該研究中，通過將 split 熒光與dCasE的N端和C-末端（ΔHis20）融合，構(gòu)建了活體RNA跟蹤工具VN-dCasE-VC。該系統(tǒng)僅在存在靶RNA時才發(fā)出熒光，從而增強(qiáng)信噪比。

在活細(xì)胞中進(jìn)行可視化的RNA追蹤，不需要特定的亞細(xì)胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T細(xì)胞中的高水平表達(dá)和均勻分布表明CasE和dCasE適合于活細(xì)胞中的RNA操作。

為了測試CasE在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時是否具有強(qiáng)活性，作者構(gòu)建了“關(guān)閉”報告基因質(zhì)粒CBS-GFP-N1。它由5′-UTR中的GFP mRNA和CasE結(jié)合位點(diǎn)（CBS）組成。當(dāng)CasE被引入系統(tǒng)時，GFP表達(dá)水平急劇下降。

為了進(jìn)一步測試CasE活性，作者還構(gòu)建了“開啟”報告基因質(zhì)粒RED-16×CBS-Lin28-C1，其中CBS插入RED單體基因的3′-UTR區(qū)和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信號，在其3′-UTR中具有l(wèi)in28信號的RED單體mRNA幾乎不能翻譯成蛋白質(zhì)。

CBS-CasE依賴限制性切斷l(xiāng)in28信號并從核釋放靶mRNA用于翻譯（圖1E和圖1F）。這些表明CasE可以結(jié)合并切割哺乳動物細(xì)胞中的CBS。

為了將dCasE-CBS相互作用設(shè)計到RNA追蹤系統(tǒng)中，作者通過將split-FP5-7與dCasE蛋白結(jié)合。發(fā)現(xiàn)一個版本，即VN-dCasE-VC很難發(fā)出熒光，這可能是由于不正確的折疊或不穩(wěn)定的狀態(tài)，但是當(dāng)與靶RNA（CBS）結(jié)合時，可以在熒光顯微鏡下清楚地捕獲熒光信號，即使VN-dCasE-VC表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量非常低。

這個示意圖畫的，真是一言難盡…

接下來作者使用VN-dCasE-VC系統(tǒng)追蹤哺乳動物細(xì)胞中過表達(dá)的β-肌動蛋白（β-Actin）的mRNA，VN-dCasE-VC系統(tǒng)在細(xì)胞質(zhì)中顯示出強(qiáng)熒光。此外還觀察到，向靶mRNA添加更多CBS可改善信號，熒光追蹤更清晰，因此，可以通過增加CBS的數(shù)量來檢測低豐度的mRNA。

總的來說，韓春雨團(tuán)隊發(fā)明了一種新的RNA追蹤工具，將其命名為VN-dCasE-VC。該系統(tǒng)能夠追蹤活細(xì)胞中沒有背景的特定RNA，通過熒光將其可視化。

目前已有兩種活細(xì)胞RNA追蹤成像工具，一種是MS2，一種是Cas13a，韓春雨團(tuán)隊開發(fā)的dCasE系統(tǒng)，成像效果由于MS2，而且，dCasE蛋白的分子量為22kDa，遠(yuǎn)小于Cas13a的130kDa，dCasE的小分子量更容易遞送至細(xì)胞內(nèi)，因此更適合用于活細(xì)胞的RNA追蹤。

需要特別說明的是，該研究目前發(fā)表于預(yù)印本網(wǎng)站，尚未經(jīng)過同行評議，生物世界如實解讀該文章，更多信息可通過文末鏈接下載獲取該論文。

通訊作者：韓春雨