撰文丨梁家琦 靳學(xué)

隨著快遞的推廣應(yīng)用，我們?nèi)粘Ｉ钪械呢浳镞f送變得異常方便。有趣的是，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞的世界里也有屬于他們的“快遞”，叫細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）。EVs是一種脂質(zhì)雙分子膜包裹的小囊泡，就好像是細(xì)胞間進(jìn)行遠(yuǎn)程通訊的一種快車 (Express Vehicle)。1983年科學(xué)家首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)EVs，當(dāng)時(shí)多數(shù)人認(rèn)為它是細(xì)胞排出廢物的一種方式。然而，2007年，瑞典哥德堡大學(xué)的L?tvall實(shí)驗(yàn)室的研究則顛覆了以往的認(rèn)知。研究者在小鼠和人肥大細(xì)胞系（MC/9和HMC-1），以及原代小鼠肥大細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中發(fā)現(xiàn)mRNA和microRNA，并且攜帶的RNA可以被遞送至新細(xì)胞中發(fā)揮功能，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的遺傳信息交換^[1]，這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)使EVs領(lǐng)域變得活躍起來(lái)。

（細(xì)胞外囊泡示意圖^[2]。Exosome（外泌體）：由內(nèi)體分泌到細(xì)胞外，大小為30-200 nm的囊泡；microvesicles（微泡）：由細(xì)胞膜分泌，大小為200-1000 nm的囊泡）

近期的研究發(fā)現(xiàn)，EVs中可以攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂類分子等生物活性成分，它可以將分子貨物轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊，或用于排出代謝物廢物。EVs在細(xì)胞間通訊中起到關(guān)鍵的信使作用，闡明EVs在疾病發(fā)生的機(jī)制中的作用，對(duì)于疾病的液體活檢和治療都具有重要的意義。清華大學(xué)藥學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心尹航教授課題組最近的研究表明，天然免疫中Toll樣受體9（TLR9）配體寡聚核苷酸（ODN）刺激巨噬細(xì)胞所分泌的EVs能夠轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，擴(kuò)大TLR9信號(hào)的激活；同時(shí)激活受體細(xì)胞中的Cdc42蛋白，以此增強(qiáng)受體細(xì)胞攝取EVs的能力。這項(xiàng)發(fā)表在Science Advances雜志上的工作首次揭示了免疫細(xì)胞在Toll樣受體激活條件下傳遞免疫免疫信號(hào)的分子機(jī)制，填補(bǔ)了EVs攝取過(guò)程中分子調(diào)節(jié)機(jī)制的空白。

Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs）是天然免疫中一類非常重要的模式識(shí)別受體，負(fù)責(zé)識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）以及損傷相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns, DAMPs），從而激活下游的免疫反應(yīng)。TLRs通路的紊亂或失調(diào)會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生各類炎癥反應(yīng)或自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。

已知在單個(gè)細(xì)胞水平上，單鏈核酸ODN可以激活TLR9，然而這種免疫激活是否能在細(xì)胞間傳遞卻尚不可知。為了研究TLR9免疫刺激的轉(zhuǎn)移，研究者利用了表達(dá)?Cre基因的藍(lán)細(xì)胞系（表達(dá)青色蛋白），以及表達(dá)LoxP基因的紅細(xì)胞系（表達(dá)紅色蛋白）組成的Cre-LoxP重組系統(tǒng)。藍(lán)細(xì)胞系在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，該系統(tǒng)分為上下兩層，中間由直徑為400 nm的濾膜分隔開(kāi)，濾膜可阻止藍(lán)細(xì)胞系遷移但允許EVs游離至紅細(xì)胞系的環(huán)境中。當(dāng)紅細(xì)胞攝入了分泌自藍(lán)細(xì)胞含Cre-mRNA的EVs后，Cre重組酶會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生Cre-LoxP重組，導(dǎo)致紅細(xì)胞表達(dá)紅色熒光的基因被切除，并開(kāi)始表達(dá)綠色熒光的基因。

（Cre-LoxP重組系統(tǒng)示意圖）

報(bào)道中應(yīng)用熒光共聚焦成像、熒光超分辨成像等技術(shù)手段，觀察熒細(xì)胞攝取EVs的情況。首先證明了ODN刺激供體細(xì)胞釋放的EVs中包含ODN，而攜帶ODN的EV在被受體細(xì)胞攝取后，會(huì)與受體細(xì)胞的TLR9作用，由此說(shuō)明了細(xì)胞在受到ODN刺激后，能通過(guò)EVs傳遞ODN到受體細(xì)胞，并結(jié)合受體細(xì)胞的TLR9。另一方面，研究者發(fā)現(xiàn)ODN的刺激供體細(xì)胞產(chǎn)生的EVs能夠更容易地被受體細(xì)胞攝取。

（超分辨顯微成像觀察細(xì)胞對(duì)EVs的攝入情況。青色：Cre-CFP細(xì)胞；綠色：GFP報(bào)告細(xì)胞；紅色：LoxP-DsRed-LoxP-GFP細(xì)胞）

EVs介導(dǎo)細(xì)胞間天然免疫的原動(dòng)力是什么？

為了探尋ODN增強(qiáng)受體細(xì)胞攝取EVs能力的分子機(jī)制，研究者針對(duì)對(duì)照組EVs （CTRL-EV）與免疫刺激后產(chǎn)生的EVs （ODN-EV）進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，最終鎖定了Cdc42蛋白。Cdc42蛋白為細(xì)胞分裂周期蛋白，屬于Rho家族的小G蛋白，調(diào)控多種細(xì)胞功能相關(guān)的信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)cdc42的基因沉默以及蛋白的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究者確認(rèn)了EVs中攜帶活化的Cdc42蛋白，并能夠刺激受體細(xì)胞中Cdc42蛋白的表達(dá)與活化，以此增強(qiáng)受體細(xì)胞攝取EVs的能力。最后，研究者通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定以及熒光共聚焦成像等手段，證明了ODN-EV能夠刺激受體細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α，進(jìn)一步激活受體細(xì)胞中的Cdc42蛋白，從而闡述了ODN刺激供體細(xì)胞，并將炎癥信號(hào)傳遞至受體細(xì)胞的分子機(jī)制。闡述的整體機(jī)制如下圖所示：

（細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)巨噬細(xì)胞間TLR9信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制示意圖。藍(lán)色：Cre-CFP細(xì)胞，紅色：LoxP-DsRed-LoxP-GFP細(xì)胞，箭頭表示囊泡和生物大分子運(yùn)動(dòng)方向）

尹航教授為國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)（International Society of Extracellular Vesicles, ISEV）理事及學(xué)術(shù)部委員，長(zhǎng)期從事細(xì)胞外囊泡相關(guān)工作。此次針對(duì)細(xì)胞通過(guò)攝取EVs調(diào)節(jié)TLR9通路信號(hào)傳遞的分子機(jī)制研究，促進(jìn)了我們理解EVs調(diào)節(jié)TLRs在細(xì)胞內(nèi)天然免疫應(yīng)答中的作用。這項(xiàng)研究結(jié)果也有助于針對(duì)Cdc42蛋白調(diào)節(jié)EVs的攝取，進(jìn)行相關(guān)炎癥疾病和自身免疫疾病的靶向療法研究。

EVs領(lǐng)域?qū)＜裔槍?duì)此項(xiàng)工作作出了評(píng)價(jià)。中國(guó)研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)、中國(guó)細(xì)胞外囊泡研究與應(yīng)用學(xué)術(shù)委員會(huì)主任委員、南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院院長(zhǎng)王前教授評(píng)價(jià)說(shuō)：“這項(xiàng)細(xì)胞外囊泡領(lǐng)域創(chuàng)新研究工作，為細(xì)胞間天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的闡釋指明了新方向，并且為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)免疫疾病診療新方案提供了思路?！?國(guó)際外泌體協(xié)會(huì)學(xué)術(shù)部主任、美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Kenneth W. Witwer教授評(píng)價(jià)該工作時(shí)稱：“來(lái)自清華大學(xué)尹航教授課題組的張瑩及同事在發(fā)表在Science Advances雜志上的最新研究中，報(bào)道了關(guān)于早期預(yù)警系統(tǒng)如何感知到感染信號(hào)這一重要現(xiàn)象。這項(xiàng)工作今后可能對(duì)機(jī)體感染相關(guān)的疾病治療研究有重要啟示，并為細(xì)胞外囊泡通訊的特定分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)?！?/p>

本文第一作者為清華大學(xué)藥學(xué)院助理研究員張瑩，通訊作者為清華大學(xué)藥學(xué)院尹航教授。

尹航教授課題組簡(jiǎn)介

尹航，清華大學(xué)藥學(xué)院全職教授、副院長(zhǎng)，藥學(xué)技術(shù)中心主任，中藥研究院院長(zhǎng)，生命科學(xué)聯(lián)合中心高級(jí)研究員，結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心研究員。研究涉及化學(xué)生物學(xué)、免疫藥物研發(fā)、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)模擬、癌癥篩查和診斷、自身免疫疾病等領(lǐng)域。

原始論文：

DOI: 10.1126/sciadv.aav1564

參考鏈接：

[1] Valadi, H., Ekstr?m, K., Bossios, A., Sj?strand, M., Lee, J.J., and L?tvall, J.O. (2007). Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology?9, 654.

[2] van Niel, G., D’Angelo, G., and Raposo, G. (2018). Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology 19, 213.