撰文丨梁家琦 靳學

隨著快遞的推廣應用，我們?nèi)粘Ｉ钪械呢浳镞f送變得異常方便。有趣的是，科學家們發(fā)現(xiàn)，在細胞的世界里也有屬于他們的“快遞”，叫細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）。EVs是一種脂質(zhì)雙分子膜包裹的小囊泡，就好像是細胞間進行遠程通訊的一種快車 (Express Vehicle)。1983年科學家首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)EVs，當時多數(shù)人認為它是細胞排出廢物的一種方式。然而，2007年，瑞典哥德堡大學的L?tvall實驗室的研究則顛覆了以往的認知。研究者在小鼠和人肥大細胞系（MC/9和HMC-1），以及原代小鼠肥大細胞產(chǎn)生的外泌體中發(fā)現(xiàn)mRNA和microRNA，并且攜帶的RNA可以被遞送至新細胞中發(fā)揮功能，實現(xiàn)細胞間的遺傳信息交換^[1]，這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)使EVs領域變得活躍起來。

（細胞外囊泡示意圖^[2]。Exosome（外泌體）：由內(nèi)體分泌到細胞外，大小為30-200 nm的囊泡；microvesicles（微泡）：由細胞膜分泌，大小為200-1000 nm的囊泡）

近期的研究發(fā)現(xiàn)，EVs中可以攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂類分子等生物活性成分，它可以將分子貨物轉移到受體細胞實現(xiàn)細胞間通訊，或用于排出代謝物廢物。EVs在細胞間通訊中起到關鍵的信使作用，闡明EVs在疾病發(fā)生的機制中的作用，對于疾病的液體活檢和治療都具有重要的意義。清華大學藥學院、結構生物學高精尖創(chuàng)新中心尹航教授課題組最近的研究表明，天然免疫中Toll樣受體9（TLR9）配體寡聚核苷酸（ODN）刺激巨噬細胞所分泌的EVs能夠轉移至受體細胞，擴大TLR9信號的激活；同時激活受體細胞中的Cdc42蛋白，以此增強受體細胞攝取EVs的能力。這項發(fā)表在Science Advances雜志上的工作首次揭示了免疫細胞在Toll樣受體激活條件下傳遞免疫免疫信號的分子機制，填補了EVs攝取過程中分子調(diào)節(jié)機制的空白。

Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs）是天然免疫中一類非常重要的模式識別受體，負責識別病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）以及損傷相關分子模式（danger-associated molecular patterns, DAMPs），從而激活下游的免疫反應。TLRs通路的紊亂或失調(diào)會引起機體產(chǎn)生各類炎癥反應或自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等。

已知在單個細胞水平上，單鏈核酸ODN可以激活TLR9，然而這種免疫激活是否能在細胞間傳遞卻尚不可知。為了研究TLR9免疫刺激的轉移，研究者利用了表達?Cre基因的藍細胞系（表達青色蛋白），以及表達LoxP基因的紅細胞系（表達紅色蛋白）組成的Cre-LoxP重組系統(tǒng)。藍細胞系在Transwell細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，該系統(tǒng)分為上下兩層，中間由直徑為400 nm的濾膜分隔開，濾膜可阻止藍細胞系遷移但允許EVs游離至紅細胞系的環(huán)境中。當紅細胞攝入了分泌自藍細胞含Cre-mRNA的EVs后，Cre重組酶會誘導產(chǎn)生Cre-LoxP重組，導致紅細胞表達紅色熒光的基因被切除，并開始表達綠色熒光的基因。

（Cre-LoxP重組系統(tǒng)示意圖）

報道中應用熒光共聚焦成像、熒光超分辨成像等技術手段，觀察熒細胞攝取EVs的情況。首先證明了ODN刺激供體細胞釋放的EVs中包含ODN，而攜帶ODN的EV在被受體細胞攝取后，會與受體細胞的TLR9作用，由此說明了細胞在受到ODN刺激后，能通過EVs傳遞ODN到受體細胞，并結合受體細胞的TLR9。另一方面，研究者發(fā)現(xiàn)ODN的刺激供體細胞產(chǎn)生的EVs能夠更容易地被受體細胞攝取。

（超分辨顯微成像觀察細胞對EVs的攝入情況。青色：Cre-CFP細胞；綠色：GFP報告細胞；紅色：LoxP-DsRed-LoxP-GFP細胞）

EVs介導細胞間天然免疫的原動力是什么？

為了探尋ODN增強受體細胞攝取EVs能力的分子機制，研究者針對對照組EVs （CTRL-EV）與免疫刺激后產(chǎn)生的EVs （ODN-EV）進行了蛋白質(zhì)組學的分析，最終鎖定了Cdc42蛋白。Cdc42蛋白為細胞分裂周期蛋白，屬于Rho家族的小G蛋白，調(diào)控多種細胞功能相關的信號通路。通過對cdc42的基因沉默以及蛋白的過表達實驗，研究者確認了EVs中攜帶活化的Cdc42蛋白，并能夠刺激受體細胞中Cdc42蛋白的表達與活化，以此增強受體細胞攝取EVs的能力。最后，研究者通過酶聯(lián)免疫吸附測定以及熒光共聚焦成像等手段，證明了ODN-EV能夠刺激受體細胞釋放炎癥因子TNF-α，進一步激活受體細胞中的Cdc42蛋白，從而闡述了ODN刺激供體細胞，并將炎癥信號傳遞至受體細胞的分子機制。闡述的整體機制如下圖所示：

（細胞外囊泡介導巨噬細胞間TLR9信號傳導機制示意圖。藍色：Cre-CFP細胞，紅色：LoxP-DsRed-LoxP-GFP細胞，箭頭表示囊泡和生物大分子運動方向）

尹航教授為國際細胞外囊泡協(xié)會（International Society of Extracellular Vesicles, ISEV）理事及學術部委員，長期從事細胞外囊泡相關工作。此次針對細胞通過攝取EVs調(diào)節(jié)TLR9通路信號傳遞的分子機制研究，促進了我們理解EVs調(diào)節(jié)TLRs在細胞內(nèi)天然免疫應答中的作用。這項研究結果也有助于針對Cdc42蛋白調(diào)節(jié)EVs的攝取，進行相關炎癥疾病和自身免疫疾病的靶向療法研究。

EVs領域專家針對此項工作作出了評價。中國研究型醫(yī)院學會副會長、中國細胞外囊泡研究與應用學術委員會主任委員、南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院院長王前教授評價說：“這項細胞外囊泡領域創(chuàng)新研究工作，為細胞間天然免疫信號轉導機制的闡釋指明了新方向，并且為進一步開發(fā)針對免疫疾病診療新方案提供了思路?！?國際外泌體協(xié)會學術部主任、美國約翰霍普金斯大學醫(yī)學院Kenneth W. Witwer教授評價該工作時稱：“來自清華大學尹航教授課題組的張瑩及同事在發(fā)表在Science Advances雜志上的最新研究中，報道了關于早期預警系統(tǒng)如何感知到感染信號這一重要現(xiàn)象。這項工作今后可能對機體感染相關的疾病治療研究有重要啟示，并為細胞外囊泡通訊的特定分子機制研究奠定了基礎?！?/p>

本文第一作者為清華大學藥學院助理研究員張瑩，通訊作者為清華大學藥學院尹航教授。

尹航教授課題組簡介

尹航，清華大學藥學院全職教授、副院長，藥學技術中心主任，中藥研究院院長，生命科學聯(lián)合中心高級研究員，結構生物學高精尖創(chuàng)新中心研究員。研究涉及化學生物學、免疫藥物研發(fā)、蛋白質(zhì)設計和計算機模擬、癌癥篩查和診斷、自身免疫疾病等領域。

原始論文：

DOI: 10.1126/sciadv.aav1564

參考鏈接：

[1] Valadi, H., Ekstr?m, K., Bossios, A., Sj?strand, M., Lee, J.J., and L?tvall, J.O. (2007). Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology?9, 654.

[2] van Niel, G., D’Angelo, G., and Raposo, G. (2018). Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology 19, 213.