研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種新技術(shù)，可以靈活地擴展基于CRISPR的分子診斷學，使用微流控芯片可以同時運行數(shù)千種測試。單片芯片的能力范圍可以從一次在1000多個樣本中檢測一種單一類型的病毒，到在少量樣本中搜索160多種不同的病毒，包括COVID-19病毒。

這項技術(shù)被稱為核酸多重評估的組合排列反應(Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids，CARMEN)，研究人員在病人樣本上進行了驗證，當天就能得到結(jié)果，將來有望應用于廣泛的公共衛(wèi)生工作。

這項研究成果發(fā)表在《自然》（Nature）雜志上，由麻省理工學院Broad研究所和哈佛大學博士后Cheri Ackerman和Cameron Myhrvold共同領(lǐng)導。Broad研究所核心成員、麻省理工學院生物工程系副教授Paul Blainey和哈佛大學教授、Broad研究所成員以及霍華德·休斯醫(yī)學研究所研究員Pardis Sabeti是這篇文章的共同通訊作者。

Sabeti說：”當前的大流行強調(diào)了快速且靈敏的工具對于診斷、監(jiān)測和確定人群中的感染的重要性。我們迫切需要可以廣泛應用于社區(qū)的創(chuàng)新型診斷方法?！?/p>

“基于CRISPR的診斷是一款頗具吸引力的工具，因為它們具有可編程性、敏感性和易用性，”Myhrvold說?！爆F(xiàn)在擴展診斷工具的能力，我們可以發(fā)掘綜合方法的潛力，例如使臨床醫(yī)生能夠確定患者是否感染多種病毒，快速找出感染源，同時對大量嚴重感染的患者進行測試?！?/p>

小型化CRISPR診斷

為了建立一款具有上述能力的測試平臺，研究團隊轉(zhuǎn)向微流控技術(shù)，他們對Blainey實驗室2018年開發(fā)的技術(shù)進行了調(diào)整和改進。研究人員創(chuàng)造了一個比手機稍微大一些的塑料芯片，上面含有數(shù)千個微孔并粘附在玻璃片上，每個微孔可以裝載一對納升級別的液滴。其中一個液滴含有樣本中的病毒遺傳物質(zhì)，另一個液滴含有病毒檢測試劑。

芯片使用的檢測方法改編自基于CRISPR的診斷測試SHERLOCK，一項由Broad研究所、麻省理工學院麥戈文腦研究所、麻省理工學院醫(yī)學工程與科學研究所和哈佛大學生物工程研究所的科學家們于2017年開發(fā)的技術(shù)。

為了使用CARMEN平臺，研究人員首先從樣本中提取病毒RNA并進行復制，這個過程類似于目前用于疑似COVID-19病例的RT-qPCR診斷法的準備過程。然后，研究人員在每個準備好的樣品中加入一種獨特的熒光色染料，并將混合物分成小液滴。

另一方面，檢測混合物中含有CRISPR蛋白Cas13，這是一種尋找特定病毒序列的引導RNA，以及報告結(jié)果的分子。這些混合物也有顏色編碼，也被分離成液滴。

成千上萬的液滴從樣品和檢測混合物中匯集在一起，并通過一個單一的管道加載到芯片上。芯片中的每個微孔能捕獲兩對液滴。當探測液滴在同一微環(huán)境的樣品液滴中找到它的目標，一種特定的病毒遺傳序列時，熒光顯微鏡就會產(chǎn)生并檢測到一個信號。整個過程，從RNA提取到結(jié)果，用時不超過8小時。

麻省理工學院Broad傳染病和微生物組項目的研究生Gowtham Thakku表示：”將這兩種技術(shù)結(jié)合在一個單一的平臺上，為我們研究臨床和流行病學問題提供了令人興奮的新能力?！?/p>

CARMEN使單片微流控芯片上的4500多個測試成為可能，該芯片可以使用現(xiàn)有的熒光編碼，以多種方式應用于患者樣本。例如，一個芯片可以同時測試一個病毒的1048個樣本，或者測試169個病毒的5個樣本。通過添加更多的芯片，可以很容易地進一步擴大容量，通常在一天內(nèi)可以運行四五個芯片。

多重功能

為了展示該平臺的多診斷能力，該團隊制定了一項策略，對數(shù)十個樣本進行快速檢測，檢測169種與人類相關(guān)的病毒，這些病毒有10多個已公布的基因組序列。研究人員使用多種芯片對58名患者的樣本進行了檢測。他們還將CARMEN應用于患者樣本，以區(qū)分A型流感毒株的亞型和檢測艾滋病毒的耐藥性突變。

該團隊還將SARS-CoV-2和其他呼吸道病原體的檢測混合物納入其中，以演示如何使用合成的病毒序列來快速檢測新出現(xiàn)的病毒。

研究人員報告稱，CARMEN在診斷測試中提供了令人印象深刻的通量和靈活性，該平臺的靈敏度與之前發(fā)表的SHERLOCK測試相當，他們還在繼續(xù)改進和利用更多的臨床樣本對CARMEN進行驗證。根據(jù)該團隊的說法，輔以研究論文中描述的來自患者樣本的成功測試數(shù)據(jù)，這種方法在臨床中很容易轉(zhuǎn)化。

Blainey說：”這種小型化的診斷方法資源效率高，易于實現(xiàn)。新工具需要創(chuàng)造力和創(chuàng)新，隨著化學和微流體技術(shù)的進步，我們對CARMEN的潛力充滿熱情，因為全民都在努力擊退COVID-19和未來的傳染病威脅。”

來源：MEMS