近期，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員劉志勇課題組在Development上，在線發(fā)表題為《嵌合CRISPR-stop技術(shù)實(shí)現(xiàn)核心基因突變的快速表型分析》的研究成果。

小鼠和人類的聽覺系統(tǒng)在發(fā)育及功能上較相似，因此，利用小鼠模型篩查耳蝸聽覺毛細(xì)胞發(fā)育過程中的重要基因?qū)γ?xì)胞再生和臨床上尋找耳聾基因的治療靶點(diǎn)具有重要意義。盡管耳蝸毛細(xì)胞在幼年和成年不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析已有報(bào)道，但目前，學(xué)界對(duì)毛細(xì)胞分化成熟的分子機(jī)制仍知之甚少，其中的一個(gè)主要原因是傳統(tǒng)的小鼠模型構(gòu)建費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通常需要先構(gòu)建F0代小鼠，然后進(jìn)行生殖細(xì)胞傳代，獲得遺傳穩(wěn)定的F1小鼠之后再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

為了快速進(jìn)行突變基因的表型篩查，劉志勇課題組在2018年建立了直接在F0代小鼠中同時(shí)敲除三個(gè)非致死基因的方法，但小鼠約25%的基因純合突變會(huì)導(dǎo)致早期胚胎流產(chǎn)或出生后致死，這導(dǎo)致之前的策略并不適合致死基因的突變篩查。解決該問題的常規(guī)策略是利用Cre/Loxp系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因突變，但該策略更費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

如何加速致死基因的表型分析呢？該研究中，研究人員首次嘗試在小鼠2細(xì)胞期卵裂球的1個(gè)細(xì)胞內(nèi)注射單堿基編輯元件和基因特異性的sgRNA，產(chǎn)生嵌合體突變的小鼠，即在該小鼠的各個(gè)器官內(nèi)，野生型（沒有基因編輯的細(xì)胞后代）和純合突變型（經(jīng)過基因編輯的細(xì)胞后代）的細(xì)胞交錯(cuò)分布，因此，該方法被命名為MosaicCRISPR-stop。

研究人員利用Atoh1基因來檢測(cè)方法的可行性。Atoh1 -/-小鼠不能產(chǎn)生耳蝸毛細(xì)胞且出生后由于呼吸節(jié)律紊亂而致死，結(jié)果顯示，利用Mosaic CRISPR-stop方法產(chǎn)生的Atoh1突變小鼠的耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量顯著減少且該小鼠可存活到成年。隨后，致死基因Sox10突變耳蝸長度縮短的表型也可被Mosaic CRISPR-stop方法重現(xiàn)。最后，研究人員利用該方法，探索了Rbm24基因（其突變導(dǎo)致心臟異常和胚胎期死亡）的功能。Rbm24在耳蝸毛細(xì)胞高峰度表達(dá)，但其功能尚未知。利用Mosaic CRISPR-stop方法，研究人員在8周內(nèi)快速鑒定出Rbm24 -/-嵌合小鼠耳蝸的表型為毛細(xì)胞大量死亡，這表明Rbm24對(duì)毛細(xì)胞的存活起重要作用，該表型也可被傳統(tǒng)的Rbm24條件性敲除小鼠模型所重復(fù)。

Mosaic CRISPR-stop研究方法不僅適用于聽覺系統(tǒng)，也適用于其他器官組織，具有普適性，可加速發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域鑒定基因功能的速度。該研究由劉志勇指導(dǎo)，主要由腦智卓越中心博士研究生王廣琴和博士后李超完成，劉志勇課題組的賀順姬對(duì)研究工作做出了貢獻(xiàn)。研究工作得到中科院、科學(xué)技術(shù)部、國家自然科學(xué)基金委的支持。

論文鏈接

　　圖1.利用Atoh1驗(yàn)證嵌合型突變方法的可靠性。（A）雙報(bào)告基因小鼠的模式圖。沒有cre表達(dá)時(shí)，所有細(xì)胞表達(dá)紅色蛋白；有cre表達(dá)時(shí)，細(xì)胞關(guān)閉紅色，開始表達(dá)綠色蛋白。（B）二細(xì)胞期受精卵的一個(gè)細(xì)胞注射cre，內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）和耳蝸（cochlea）同時(shí)含有綠色和紅色的細(xì)胞。（C）Atoh1基因兩個(gè)高效的sgRNA（1+3）的位置示意圖。（D）在二細(xì)胞期受精卵的一個(gè)細(xì)胞內(nèi)注射cre， 單堿基編輯系統(tǒng)（BE3）和 2個(gè)針對(duì)Atoh1基因的sgRNA（1+3），直接產(chǎn)生的F0小鼠是嵌合型純合突變，可用于快速的表型分析。（E-F）相對(duì)于對(duì)照組（E），嵌合型純合突變小鼠耳蝸的毛細(xì)胞數(shù)量顯著減少。

　　圖2.利用嵌合型突變方法快速鑒定出Rbm24是維持耳蝸外毛細(xì)胞存活的重要基因之一。（A）二細(xì)胞期受精卵的其中一個(gè)細(xì)胞注射更新版本的單堿基編輯系統(tǒng)（hA3A-BE3）和Rbm24特異的sgRNA-1，直接產(chǎn)生的嵌合型純合突變F0小鼠可以立即用于表型分析。（B-C’）相對(duì)于對(duì)照組 （B 和B’），嵌合型純合突變耳蝸（C和C’）的外毛細(xì)胞大量死亡。白色箭頭所示是殘留的、依然表達(dá)Rbm24的外毛細(xì)胞（Prestin+）。（D）跟注射LacZ sgRNA（藍(lán)色）的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組（紅色）的外毛細(xì)胞數(shù)量顯著降低。

來源： 腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心