基因異常表達及突變引起的疾病往往不能夠被傳統(tǒng)藥物所治愈，有效的基因表達干預成為治療這類疾病的唯一方法。RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)之后，該技術(shù)迅速被科研人員應用于疾病治療領(lǐng)域，使基因治療的發(fā)展迎來了巨大的契機。該技術(shù)通過導入小干擾RNA（siRNA）特異性抑制致病靶向基因的表達，起到治療疾病的作用。遺憾的是，雖然RNAi技術(shù)讓人們看到了基因治療的曙光，但是siRNA的體內(nèi)遞送問題一直阻礙著RNAi技術(shù)的臨床應用。如何讓siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定傳輸，能否找到一種安全、可靠、與機體高度兼容的遞送載體，一直是RNAi轉(zhuǎn)化應用的核心科學問題。

南京大學張辰宇團隊的前期研究發(fā)現(xiàn)，細胞可以包裹小RNA（miRNA和siRNA）到外泌體并將外泌體分泌到細胞外；分泌的小RNA隨后會被受體細胞攝取，調(diào)節(jié)受體細胞中的基因表達。由于外泌體是細胞自身分泌的囊泡，與其他載體相比，其具有低免疫源性和低毒性的特點，是一種良好的小RNA天然載體。因此很多研究人員迅速開始著手嘗試利用外泌體遞送siRNA。在傳統(tǒng)的基于外泌體的siRNA遞送策略中，siRNA需要在體外細胞培養(yǎng)環(huán)境與外泌體進行預組裝，然后通過超速離心等技術(shù)從培液上清中分離純化細胞分泌的、包裹好siRNA的外泌體，從而得到外泌體siRNA并進行體內(nèi)注射。該方法成本較高，過程復雜不易控制，分離得到的外泌體難以達到臨床需求，限制了其大規(guī)模實際應用。

2021年3月29日，南京大學張辰宇/陳熹/閆超/李菁團隊在Cell Research?發(fā)表論文“Invivo self-assembled small RNAs as a new generation of RNAi therapeutics”，建立了新一代的siRNA遞送及基因治療技術(shù)，基于體內(nèi)自組裝外泌體siRNA的策略，實現(xiàn)siRNA從表達到裝載再到遞送的全體內(nèi)自動化過程。該技術(shù)利用合成生物學設(shè)計理念，通過向小鼠靜脈注射可表達siRNA和外泌體膜表面靶向肽段的合成生物學基因環(huán)路（以質(zhì)粒DNA的形式），將小鼠的肝臟重構(gòu)成可以產(chǎn)生和分泌siRNA的器官，繼而利用機體自身的外泌體體內(nèi)傳輸途徑，實現(xiàn)siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定、高效、安全的傳輸。利用該策略，研究人員成功實現(xiàn)了對肺癌、膠質(zhì)母細胞瘤和肥胖三種疾病的靶基因干預，達到了顯著的治療效果。

首先，研究人員在體外構(gòu)建了可以表達siRNA的基因環(huán)路，該基因環(huán)路可靈活的實現(xiàn)多個siRNA和靶向肽段的插入。通過靜脈注射將基因環(huán)路導入體內(nèi)，結(jié)果顯示，基因環(huán)路主要被肝臟攝取。進一步實驗顯示基因環(huán)路可在肝細胞內(nèi)表達，并指導肝細胞自動生產(chǎn)siRNA及自組裝siRNA進入外泌體，自組裝的外泌體siRNA進而隨血液循環(huán)進入肺、腎等多個組織器官。基于此，研究人員在LLC原位移植瘤肺癌模型和KRAS突變的原發(fā)肺癌模型中，證實了靶向EGFR和KRAS的siRNA可以被高效遞送到肺腫瘤組織并有效降低靶基因的表達，顯著抑制了腫瘤的生長并延長了小鼠的生存期。

另一方面，通過在基因環(huán)路中插入與外泌體膜表面蛋白相融合的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的肽段（狂犬病毒肽段RVG），可以實現(xiàn)在體內(nèi)自組裝產(chǎn)生靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的攜帶siRNA的外泌體。結(jié)果顯示通過該復合基因環(huán)路體內(nèi)自組裝而成的外泌體siRNA可以高效的穿過血腦屏障，將siRNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。研究人員通過遞送兩個靶向膠質(zhì)母細胞瘤致病基因（EGFR和TNC）的siRNA，顯著緩解了顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長，延長了小鼠的生存期。進一步，通過向下丘腦遞送靶向PTP1B（該基因敲除小鼠抵抗高脂誘導的肥胖）的siRNA，可同時恢復肥胖小鼠的瘦素敏感性和胰島素敏感性，增加小鼠的能量代謝，起到緩解肥胖的效果。

綜上，該研究闡述了一種劃時代的siRNA遞送及基因治療技術(shù)，其優(yōu)勢體現(xiàn)在：（1）利用宿主自己的器官分泌的外泌體為載體，完全解決了siRNA遞送載體帶來的免疫源性和毒性問題；（2）通過對基因環(huán)路的靈活編輯，可同時傳輸多個siRNA，對疾病進行多靶點打擊；（3）特異性的靶向肽段可高效的將siRNA輸送到特定的組織，克服血腦屏障等生物屏障的制約。由于該技術(shù)使用的合成生物學基因環(huán)路的本質(zhì)是質(zhì)粒，其設(shè)計、生產(chǎn)和應用均非常簡單，因此利于該技術(shù)的迅速推廣和拓展，將極大促進RNAi治療的發(fā)展，具有重大的臨床轉(zhuǎn)化價值，有望成為RNAi治療領(lǐng)域的里程碑，開啟基因治療的新篇章。

來源：南京大學