作為神經(jīng)系統(tǒng)信息交流的“通貨”，神經(jīng)電活動是大腦處理復雜信息的物理基礎。與膜片鉗和微電極陣列記錄等基于電極材料的傳統(tǒng)電生理技術相比，熒光膜電位成像在時空分辨率、測量通量等方面具有明顯的優(yōu)勢。其中，發(fā)射波長在遠紅區(qū)（640 nm以上）的熒光探針由于其紅移的光譜具有更強組織穿透能力，而且可適于多通路成像觀測，因而備受研究人員青睞。然而目前可使用的遠紅區(qū)膜電位探針在亮度和靈敏度方面存在嚴重缺陷，因此亟需發(fā)展適用于記錄神經(jīng)元動作電位的高性能熒光探針。

2021年4月15日，北京大學化學與分子工程學院鄒鵬課題組與陳鵬課題組共同在Nature Chemistry雜志在線發(fā)表了他們最新的研究成果“A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neurons”。他們綜合利用生物正交反應和膜蛋白工程化改造策略，開發(fā)出一系列具有高靈敏度和成像信噪比的熒光膜電位探針HVI（hybrid voltage indicator）。根據(jù)成像光譜需求，HVI的蛋白質骨架可借助生物正交反應搭配不同化學結構的熒光染料，構建出一系列跨越可見光譜的復合型探針。其中，橙紅區(qū)探針HVI-Cy3具有最高的靈敏度，能夠以高達90的信噪比成像記錄神經(jīng)動作電位；遠紅區(qū)探針HVI-Cy5具有最紅移的光譜，不僅可與綠色或紅色熒光探針同時使用，實現(xiàn)膜電位與鈣離子、神經(jīng)遞質等重要生理信號的并行觀測，還能夠與光遺傳學工具聯(lián)用，實現(xiàn)全光學神經(jīng)電生理檢測。

圖1.復合型膜電位探針HVI檢測神經(jīng)元膜電位概念圖

鄒鵬課題組長期致力于發(fā)展和應用化學探針技術，研究參與神經(jīng)信號轉導過程的生物大分子、支配神經(jīng)活動的化學和物理信號。他們率先提出“復合型膜電位探針”的概念，利用化學手段將熒光染料與視紫紅質蛋白相偶聯(lián)，利用后者的電致變色效應實現(xiàn)膜電位成像（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3949-3953）。陳鵬課題組長期致力于發(fā)展適用于活細胞及活體動物的生物正交反應，并通過遺傳編碼技術，實現(xiàn)了蛋白質的特異標記、激活與調控（Nat. Chem. Biol. 2016,12,129-137）。在最新的研究成果中，兩個課題組合作，將化學反應策略與蛋白質骨架改造相結合，對神經(jīng)元的膜蛋白進行了原位的“生物正交”工程優(yōu)化。一方面，鑒于目前大多數(shù)生物正交反應難以高效地標記膜蛋白，以及點擊化學反應（銅催化炔基-疊氮環(huán)加成反應）對神經(jīng)元的毒性，他們改用了生物相容性更好、效率更高的逆電子需求狄爾斯-阿爾德反應（IEDDA），將高熒光量子產(chǎn)率的遠紅區(qū)染料引入工程改造的視紫紅質蛋白的特異位點。另一方面，他們針對視紫紅質蛋白Ace2中的關鍵質子受體氨基酸殘基進行突變篩選，最終得到了消除穩(wěn)態(tài)光電流且亮度及靈敏度顯著提升的遠紅區(qū)復合型探針HVI-Cy5。當神經(jīng)元膜電勢發(fā)生去極化時，質子電化學勢的改變促進視黃醛席夫堿的質子化，從而改變視紫紅質的吸收光譜，最終通過FRET效應影響其偶聯(lián)熒光染料的量子產(chǎn)率，導致熒光信號變化（圖2）。

圖2.復合型膜電位探針HVI熒光標記方法示意圖及探針響應細胞膜電位變化原理圖

實驗表明，HVI-Cy5可與光遺傳學工具聯(lián)用（圖3）。研究人員用短波長光單向或者雙向調控神經(jīng)元興奮性，同時在遠紅區(qū)熒光通道記錄膜電位變化，擴充了全光學電生理學工具箱（圖3a-c）。該技術相比于傳統(tǒng)的多電極膜片鉗刺激并記錄，技術難度明顯下降。HVI-Cy5還可以與其他熒光探針進行雙色成像，無串擾監(jiān)測細胞膜電勢及鈣離子、遞質和pH等生理信號（圖3d-f）。多色成像將幫助研究者更好地了解膜電位與其他生理信號動態(tài)變化的聯(lián)系和差異。

圖3.具有深紅熒光光譜的HVI-Cy5可與光遺傳學工具及鈣探針聯(lián)用實現(xiàn)全光學電生理檢測

此外，實驗將HVI-Cy5與光遺傳學工具分別表達在不同的大鼠海馬體神經(jīng)元中，利用膜電位成像評估APV和NBQX兩種藥物對神經(jīng)元突觸連接的影響，解析了NMDAR和AMPAR兩類谷氨酸受體對突觸信號傳遞的貢獻（圖4）。未來，HVI-Cy5有望用于在體外篩選作用于受體蛋白的激動劑或拮抗劑。

圖4.將HVI-Cy5與光遺傳學工具分別表達在不同神經(jīng)元中可以研究藥物對神經(jīng)突觸的作用

總之，本文通過對視紫紅質膜蛋白的“生物正交”工程優(yōu)化，發(fā)展了適用于神經(jīng)元電信號記錄的遠紅區(qū)高性能熒光探針HVI-Cy5，實現(xiàn)多色成像和全光學電生理學應用，期待該探針能夠幫助研究者解讀更加復雜的神經(jīng)元電生理信號。

北京大學化學與分子工程學院博士研究生劉書彰、林暢，北大-清華生命聯(lián)合中心博士畢業(yè)生胥永顯（現(xiàn)浙江大學醫(yī)學中心博士后）為該論文的共同第一作者。鄒鵬研究員和陳鵬教授為該論文的共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京分子科學國家研究中心和北大-清華生命科學聯(lián)合中心的資助。

來源：北京大學