2020年，基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立的基因組編輯技術獲得“2020年度諾貝爾化學獎”。該生物技術起源于科學家對微生物中一種特殊的免疫系統(tǒng)（即CRISPR-Cas系統(tǒng)）的研究。CRISPR-Cas系統(tǒng)是在原核微生物（古菌和細菌）中廣泛存在的抗病毒（噬菌體）免疫系統(tǒng)。宿主菌通過將入侵病毒的特定DNA序列插入其CRISPR結構中，可形成對該病毒的永久性“記憶”。這些記憶性序列（稱為spacer）可轉錄加工生成crRNA，指導CRISPR-Cas系統(tǒng)效應物（如Cas9或Cascade復合物）特異性識別和切割再次入侵的病毒，實現(xiàn)對該類病毒的適應性免疫。CRISPR-Cas系統(tǒng)豐富多樣的功能組分和核酸靶向機制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)）和基因檢測技術（如CRISPR-Cas13a系統(tǒng)），是近十余年來生命科學研究的前沿。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在微生物基因組中穩(wěn)定性維持是其抗病毒功能實現(xiàn)的關鍵基礎。一方面，CRISPR-Cas系統(tǒng)具有自我免疫的風險，并可能阻礙有益外源基因的獲取，因此可對宿主細胞造成適合度代價（fitness cost）而可能在進化過程中頻繁丟失。另一方面，微生物宿主與其病毒的“軍備競賽”中，CRISPR-Cas系統(tǒng)也會成為病毒反攻（Anti-CRISPR）的目標而喪失功能。面對多重的進化壓力和適應性挑戰(zhàn)，CRISPR-Cas系統(tǒng)為何能在微生物中廣泛存在（存在于約90%的古菌和40%細菌中）并發(fā)揮其功能？在微生物宿主基因組中是否存在一類保護CRISPR-Cas功能但至今尚未被揭示的“暗物質”？這些問題有待進一步探究。

2021年4月30日，Science以長文形式在線發(fā)表了中國科學院微生物研究所研究員向華/李明團隊的最新研究成果，論文題目為Toxin-antitoxin RNA pairs safeguard CRISPR-Cas systems?？蒲腥藛T首次在自然界分布廣泛的I型CRISPR-Cas基因簇內部發(fā)現(xiàn)了一類特殊的RNA“暗物質”：一類對其偶聯(lián)的CRISPR-Cas系統(tǒng)具護衛(wèi)功能的一對RNA的毒素-抗毒素（CreTA）系統(tǒng)。由于CRISPR-Cas系統(tǒng)可利用RNA抗毒素CreA控制RNA毒素CreT的表達，使宿主菌無法丟失其CRISPR-Cas系統(tǒng)（對其“上癮”）。一旦CRISPR-Cas組分被破壞，就會誘導CreT毒素的表達，從而抑制甚或殺死該宿主菌（圖1），從而保護CRISPR-Cas系統(tǒng)在細胞群體中的穩(wěn)定存在?！俺砂a”機制的發(fā)現(xiàn)為理解CRISPR-Cas系統(tǒng)的穩(wěn)定性維持和廣泛性分布提供了全新視角，研究還揭示了一大類新的功能多樣的小RNA（曾被稱為基因組中的“暗物質”），開辟了新的研究領域。

　　2014年，向華/李明團隊即利用西班牙鹽盒菌（Haloarcula hispanica）及其病毒在國際上建立了第一個I型CRISPR系統(tǒng)的高效適應模型，揭示出CRISPR系統(tǒng)對病毒高效適應需要引發(fā)的規(guī)律，并深入解析了“引發(fā)適應”過程精細的分子機制，包括Cascade與crRNA的可塑性。研究發(fā)現(xiàn)，4個成簇的編碼CRISPR效應復合物Cascade的基因（cas6-cas8-cas7-cas5）無法單獨敲除，但可作為整體一起敲除，從而推測這個基因簇內部可能隱藏了一個未知的“細胞成癮”元件。經過7年探索，科研人員最終在cas6與cas8之間一段僅311 bp的基因間區(qū)內發(fā)現(xiàn)一類新的小RNA毒素-抗毒素系統(tǒng)，分別命名為CreT（RNA毒素）和CreA（RNA抗毒素）。CreTA通過與CRISPR效應復合物4個編碼基因的結構與功能的偶聯(lián)，守護了CRISPR-Cas系統(tǒng)的穩(wěn)定性（圖1）。該研究的主要創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)包括：首次發(fā)現(xiàn)受Cascade蛋白控制的小RNA毒素；解析了小分子RNA毒素CreT獨特的抑菌機制；發(fā)現(xiàn)CreA抗毒素——類似crRNA的小分子RNA；揭示CreA RNA聯(lián)合Cascade發(fā)揮抗毒素活性的分子機制；揭示CreTA對CRISPR-Cas系統(tǒng)的護衛(wèi)功能；揭示CreTA同源或類似系統(tǒng)在不同微生物和不同CRISPR亞型中的普遍存在。

　　微生物所研究員向華和李明為該論文共同通訊作者，李明、向華研究組博士后龔路遙和博士生程飛躍為論文并列第一作者。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）生物技術信息中心（NCBI）教授Eugene Koonin及其團隊給予了幫助。研究工作得到中科院戰(zhàn)略性先導科技專項、國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、國家轉基因重大科技專項、中國科協(xié)青年人才托舉工程和中科院青年創(chuàng)新促進會等的支持。

　　論文鏈接

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圖1.CRISPR-Cas系統(tǒng)與CreTA毒素-抗毒素系統(tǒng)的互作機制

圖2.creTA在CRISPR-cas基因簇中的位置及功能分析

圖3.CreT毒素通過劫持胞內稀有的精氨酸t(yī)RNA^UCU抑制菌體生長

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　　圖4.CreA模擬crRNA指導Cascade特異性抑制creT啟動子

　　圖5.CreTA保護Cascade基因簇的遺傳穩(wěn)定性

來源： 微生物研究所