2021 年6月10 日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孔道春實(shí)驗(yàn)室在美國(guó)科學(xué)院期刊PNAS在線發(fā)表了題為“The intra-S phase checkpoint directly regulates replication elongation to preserve the integrity of stalled replisomes” 的研究論文。該研究回答了過去50年在checkpoint（細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)）調(diào)控維持真核細(xì)胞DNA 復(fù)制叉穩(wěn)定領(lǐng)域的兩個(gè)核心問題：1）停頓的DNA 復(fù)制叉為什么會(huì)不穩(wěn)定，并傾向于垮塌；2）checkpoint調(diào)控維持停頓復(fù)制叉穩(wěn)定的核心分子機(jī)制是什么？

正常細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，基因組不穩(wěn)定主要是來(lái)自于DNA復(fù)制錯(cuò)誤，大約2/3癌癥的發(fā)生被認(rèn)為是由于DNA復(fù)制錯(cuò)誤導(dǎo)致的【Tomasetti & Vogelstein(2015), Science, 347: 78-81;Tomasetti et al. (2017), Science, 355:1330-1334】，而DNA復(fù)制錯(cuò)誤主要是來(lái)自于DNA復(fù)制叉的不穩(wěn)定。DNA復(fù)制叉主要由兩部分構(gòu)成（圖1）：Y字型的DNA結(jié)構(gòu)和DNA復(fù)制體(Replisome)。DNA復(fù)制體包含一系列與復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，最重要的是打開雙鏈DNA模板的CMG（Cdc45-MCM-GINS）解旋酶復(fù)合物，以及進(jìn)行新生鏈DNA合成的DNA聚合酶——DNAPolα、δ、ε。正常移動(dòng)的DNA復(fù)制叉是相對(duì)穩(wěn)定的，DNA復(fù)制體中的CMG解旋酶與DNA聚合酶在物理及生化功能上緊密偶聯(lián)。但當(dāng)DNA復(fù)制叉遭遇復(fù)制障礙停頓下來(lái)時(shí)，停頓的DNA復(fù)制叉被證明是不穩(wěn)定的，傾向于垮塌。

上個(gè)世紀(jì)60年代末，研究人員在裂殖酵母里篩選到了一株突變株，命名為rad3-136。很快發(fā)現(xiàn)rad3-136突變株對(duì)羥基脲【Hydroxyurea (HU), 抑制dNTPs合成，導(dǎo)致DNA復(fù)制叉停頓】高度敏感。至此，細(xì)胞維持停頓DNA復(fù)制叉穩(wěn)定的機(jī)制研究拉開了序幕。Rad3及相關(guān)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)控，于1988年被命名為checkpoint調(diào)控【W(wǎng)einert & Hartwell(1988), Science,241:317-322】, Rad3被歸類為ATR激酶。過去50年，前后上千個(gè)實(shí)驗(yàn)室，用兩代人的時(shí)間，發(fā)表了上萬(wàn)篇研究文章，證明checkpoint是維持停頓DNA復(fù)制叉穩(wěn)定的必需細(xì)胞調(diào)控。在checkpoint缺失或缺陷的細(xì)胞，停頓的DNA復(fù)制叉發(fā)生垮塌，導(dǎo)致DNA復(fù)制不能完成，以及基因組的極度不穩(wěn)定。但是，研究組在試圖闡明checkpoint調(diào)控維持DNA復(fù)制叉穩(wěn)定的機(jī)制研究方面，碰到了極大阻力，阻力主要是來(lái)自于checkpoint調(diào)控的靶蛋白極難被確定，已發(fā)表文章的結(jié)論也互相矛盾，導(dǎo)致checkpoint調(diào)控維持DNA復(fù)制叉穩(wěn)定的核心機(jī)制長(zhǎng)期得不到確定。

圖1 真核細(xì)胞DNA復(fù)制叉及S期細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)【Leman AR, NoguchiE. The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication.Genes.2013Mar;4(1):1-32.】。酵母Chk2在高等真核生物的功能同源蛋白是Chk1

通過大規(guī)模的遺傳篩選，孔道春實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，復(fù)制解旋酶CMG（Cdc45-MCM- GINS）復(fù)合體的一個(gè)亞基Cdc45的突變能極大降低（600-3000 倍）checkpoint通路缺陷的細(xì)胞對(duì)HU 的敏感性，暗示Cdc45或CMG復(fù)合體可能被checkpoint調(diào)控。通過一系列遺傳及生化分析，證明Rad3^ATR-Cds1^Chk2 checkpoint 通路直接調(diào)控DNA復(fù)制解旋酶CMG復(fù)合體?？椎来簩?shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)：當(dāng)DNA復(fù)制叉停頓后，Cds1^Chk2 同時(shí)磷酸化Cdc45 亞基上的三個(gè)絲氨酸殘基（且這三個(gè)Chk2/Chk1 磷酸化位點(diǎn)在不同物種中相對(duì)保守）。這三個(gè)絲氨酸殘基的磷酸化導(dǎo)致CMG復(fù)制解旋酶活性深度降低。CMG復(fù)制解旋酶活性的降低使得它不能脫離停頓復(fù)制叉，不能與被阻擋的DNA 聚合酶分開。

這樣，停頓的DNA復(fù)制體（Replisome）及復(fù)制叉的生化完整性得到了維持，從而阻止了停頓DNA 復(fù)制叉的垮塌。

為什么停頓復(fù)制叉里的復(fù)制解旋酶與DNA聚合酶會(huì)傾向于分開呢？這關(guān)聯(lián)到兩件事情：一是DNA復(fù)制體或DNA復(fù)制叉的基本生化特性；二是正常細(xì)胞生長(zhǎng)過程中導(dǎo)致復(fù)制叉停頓的基本原因。DNA復(fù)制體中，DNA Pol ε負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈（leading strand）合成， DNA Polα和δ負(fù)責(zé)后隨鏈（laggingstrand）合成。由于后隨鏈的合成稍微滯后于CMG解旋酶介導(dǎo)的DNA鏈解開，導(dǎo)致后隨鏈的DNA模板上恒定的出現(xiàn)一段約200核苷酸長(zhǎng)度的單鏈DNA區(qū)域。如果該單鏈DNA區(qū)域有形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，如G4、三股鏈、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成就是一個(gè)大概率事件。形成的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻擋DNA Pol α、δ的移動(dòng)，導(dǎo)致復(fù)制叉停頓。在酵母細(xì)胞的染色體DNA上，大約有2000-4000個(gè)能形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列。在人細(xì)胞中，能形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)目大約有數(shù)百萬(wàn)個(gè)（~75萬(wàn)個(gè)G4結(jié)構(gòu)，及數(shù)倍于G4的三股鏈結(jié)構(gòu)等）。因此，DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的復(fù)制叉停頓是一個(gè)經(jīng)常發(fā)生的生物事件。在前導(dǎo)鏈或后隨鏈的DNA模板上，如果有堿基損傷（每個(gè)人細(xì)胞每天有約10⁵級(jí)別的這類損傷）或化學(xué)修飾，也會(huì)阻擋DNA Polα、δ、ε（DNA聚合酶的活性中心非常精巧，只能容納AT或GC配對(duì)，但不能容納AC或GT配對(duì)，以保證DNA復(fù)制的精準(zhǔn)性），導(dǎo)致復(fù)制叉停頓。當(dāng)DNA聚合酶被阻擋后，CMG解旋酶還要往前移動(dòng)，這樣就會(huì)導(dǎo)致CMG 解旋酶與DNA聚合酶物理上的分開，導(dǎo)致復(fù)制叉垮塌。

經(jīng)過上千個(gè)實(shí)驗(yàn)室50年的不懈努力，checkpoint調(diào)控維持停頓DNA復(fù)制叉穩(wěn)定的核心機(jī)制最終得到了闡明。即，1）停頓復(fù)制叉不穩(wěn)定、傾向于垮塌的根本原因是：當(dāng)DNA聚合酶被阻擋后，復(fù)制解旋酶與DNA聚合酶傾向于分開；2）checkpoint調(diào)控維持停頓復(fù)制叉穩(wěn)定的核心機(jī)制是：降低復(fù)制解旋酶的活性，阻止復(fù)制解旋酶脫離復(fù)制叉或DNA聚合酶，維持兩者之間在物理及生化功能上的緊密偶聯(lián)，從而維持停頓復(fù)制叉穩(wěn)定，并保持它的生物學(xué)功能（圖2）?？椎来簩?shí)驗(yàn)室于2019年發(fā)現(xiàn)的chromsfork調(diào)控，通過提高停頓復(fù)制叉周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密程度，也是為了阻擋復(fù)制解旋酶脫離復(fù)制叉，以維持復(fù)制叉穩(wěn)定【Feng et al.(2019),PNAS, 116(29):14563- 14572】。

圖2. Cds1Chk2 磷酸化復(fù)制解旋酶CMG 里的Cdc45 亞基，深度降低復(fù)制解旋酶活性，阻止復(fù)制解旋酶與DNA 聚合酶分開，從而穩(wěn)定停頓復(fù)制叉

孔道春教授為該論文的通訊作者。劉陽(yáng)博士和王露（2015級(jí)博士研究生）為該論文的共同第一作者。許鑫、袁越、張波、李澤陽(yáng)、謝雨晨、閆睿、鄭澤琦、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院紀(jì)建國(guó)教授、英國(guó)Sussex大學(xué)的Johanne M. Murray 和Antony M. Carr 教授也對(duì)本研究作出重要貢獻(xiàn)。本工作得到了北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、蛋白質(zhì)與植物基因研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，以及生命科學(xué)學(xué)院儀器中心（成像平臺(tái)及流式平臺(tái)）的大力支持。

來(lái)源：北京大學(xué)