2021 年6月10 日，北京大學生命科學學院孔道春實驗室在美國科學院期刊PNAS在線發(fā)表了題為“The intra-S phase checkpoint directly regulates replication elongation to preserve the integrity of stalled replisomes” 的研究論文。該研究回答了過去50年在checkpoint（細胞周期檢驗點）調控維持真核細胞DNA 復制叉穩(wěn)定領域的兩個核心問題：1）停頓的DNA 復制叉為什么會不穩(wěn)定，并傾向于垮塌；2）checkpoint調控維持停頓復制叉穩(wěn)定的核心分子機制是什么？

正常細胞生長過程中，基因組不穩(wěn)定主要是來自于DNA復制錯誤，大約2/3癌癥的發(fā)生被認為是由于DNA復制錯誤導致的【Tomasetti & Vogelstein(2015), Science, 347: 78-81;Tomasetti et al. (2017), Science, 355:1330-1334】，而DNA復制錯誤主要是來自于DNA復制叉的不穩(wěn)定。DNA復制叉主要由兩部分構成（圖1）：Y字型的DNA結構和DNA復制體(Replisome)。DNA復制體包含一系列與復制相關的蛋白質及蛋白質復合物，其中，最重要的是打開雙鏈DNA模板的CMG（Cdc45-MCM-GINS）解旋酶復合物，以及進行新生鏈DNA合成的DNA聚合酶——DNAPolα、δ、ε。正常移動的DNA復制叉是相對穩(wěn)定的，DNA復制體中的CMG解旋酶與DNA聚合酶在物理及生化功能上緊密偶聯(lián)。但當DNA復制叉遭遇復制障礙停頓下來時，停頓的DNA復制叉被證明是不穩(wěn)定的，傾向于垮塌。

上個世紀60年代末，研究人員在裂殖酵母里篩選到了一株突變株，命名為rad3-136。很快發(fā)現(xiàn)rad3-136突變株對羥基脲【Hydroxyurea (HU), 抑制dNTPs合成，導致DNA復制叉停頓】高度敏感。至此，細胞維持停頓DNA復制叉穩(wěn)定的機制研究拉開了序幕。Rad3及相關蛋白介導的細胞調控，于1988年被命名為checkpoint調控【W(wǎng)einert & Hartwell(1988), Science,241:317-322】, Rad3被歸類為ATR激酶。過去50年，前后上千個實驗室，用兩代人的時間，發(fā)表了上萬篇研究文章，證明checkpoint是維持停頓DNA復制叉穩(wěn)定的必需細胞調控。在checkpoint缺失或缺陷的細胞，停頓的DNA復制叉發(fā)生垮塌，導致DNA復制不能完成，以及基因組的極度不穩(wěn)定。但是，研究組在試圖闡明checkpoint調控維持DNA復制叉穩(wěn)定的機制研究方面，碰到了極大阻力，阻力主要是來自于checkpoint調控的靶蛋白極難被確定，已發(fā)表文章的結論也互相矛盾，導致checkpoint調控維持DNA復制叉穩(wěn)定的核心機制長期得不到確定。

圖1 真核細胞DNA復制叉及S期細胞周期檢驗點【Leman AR, NoguchiE. The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication.Genes.2013Mar;4(1):1-32.】。酵母Chk2在高等真核生物的功能同源蛋白是Chk1

通過大規(guī)模的遺傳篩選，孔道春實驗室發(fā)現(xiàn)，復制解旋酶CMG（Cdc45-MCM- GINS）復合體的一個亞基Cdc45的突變能極大降低（600-3000 倍）checkpoint通路缺陷的細胞對HU 的敏感性，暗示Cdc45或CMG復合體可能被checkpoint調控。通過一系列遺傳及生化分析，證明Rad3^ATR-Cds1^Chk2 checkpoint 通路直接調控DNA復制解旋酶CMG復合體?？椎来簩嶒炇野l(fā)現(xiàn)：當DNA復制叉停頓后，Cds1^Chk2 同時磷酸化Cdc45 亞基上的三個絲氨酸殘基（且這三個Chk2/Chk1 磷酸化位點在不同物種中相對保守）。這三個絲氨酸殘基的磷酸化導致CMG復制解旋酶活性深度降低。CMG復制解旋酶活性的降低使得它不能脫離停頓復制叉，不能與被阻擋的DNA 聚合酶分開。

這樣，停頓的DNA復制體（Replisome）及復制叉的生化完整性得到了維持，從而阻止了停頓DNA 復制叉的垮塌。

為什么停頓復制叉里的復制解旋酶與DNA聚合酶會傾向于分開呢？這關聯(lián)到兩件事情：一是DNA復制體或DNA復制叉的基本生化特性；二是正常細胞生長過程中導致復制叉停頓的基本原因。DNA復制體中，DNA Pol ε負責合成前導鏈（leading strand）合成， DNA Polα和δ負責后隨鏈（laggingstrand）合成。由于后隨鏈的合成稍微滯后于CMG解旋酶介導的DNA鏈解開，導致后隨鏈的DNA模板上恒定的出現(xiàn)一段約200核苷酸長度的單鏈DNA區(qū)域。如果該單鏈DNA區(qū)域有形成DNA二級結構的序列，如G4、三股鏈、發(fā)夾結構等，DNA二級結構的形成就是一個大概率事件。形成的DNA二級結構會阻擋DNA Pol α、δ的移動，導致復制叉停頓。在酵母細胞的染色體DNA上，大約有2000-4000個能形成DNA二級結構的序列。在人細胞中，能形成DNA二級結構的數(shù)目大約有數(shù)百萬個（~75萬個G4結構，及數(shù)倍于G4的三股鏈結構等）。因此，DNA二級結構導致的復制叉停頓是一個經常發(fā)生的生物事件。在前導鏈或后隨鏈的DNA模板上，如果有堿基損傷（每個人細胞每天有約10⁵級別的這類損傷）或化學修飾，也會阻擋DNA Polα、δ、ε（DNA聚合酶的活性中心非常精巧，只能容納AT或GC配對，但不能容納AC或GT配對，以保證DNA復制的精準性），導致復制叉停頓。當DNA聚合酶被阻擋后，CMG解旋酶還要往前移動，這樣就會導致CMG 解旋酶與DNA聚合酶物理上的分開，導致復制叉垮塌。

經過上千個實驗室50年的不懈努力，checkpoint調控維持停頓DNA復制叉穩(wěn)定的核心機制最終得到了闡明。即，1）停頓復制叉不穩(wěn)定、傾向于垮塌的根本原因是：當DNA聚合酶被阻擋后，復制解旋酶與DNA聚合酶傾向于分開；2）checkpoint調控維持停頓復制叉穩(wěn)定的核心機制是：降低復制解旋酶的活性，阻止復制解旋酶脫離復制叉或DNA聚合酶，維持兩者之間在物理及生化功能上的緊密偶聯(lián)，從而維持停頓復制叉穩(wěn)定，并保持它的生物學功能（圖2）?？椎来簩嶒炇矣?019年發(fā)現(xiàn)的chromsfork調控，通過提高停頓復制叉周圍的染色質結構緊密程度，也是為了阻擋復制解旋酶脫離復制叉，以維持復制叉穩(wěn)定【Feng et al.(2019),PNAS, 116(29):14563- 14572】。

圖2. Cds1Chk2 磷酸化復制解旋酶CMG 里的Cdc45 亞基，深度降低復制解旋酶活性，阻止復制解旋酶與DNA 聚合酶分開，從而穩(wěn)定停頓復制叉

孔道春教授為該論文的通訊作者。劉陽博士和王露（2015級博士研究生）為該論文的共同第一作者。許鑫、袁越、張波、李澤陽、謝雨晨、閆睿、鄭澤琦、北京大學生命科學學院紀建國教授、英國Sussex大學的Johanne M. Murray 和Antony M. Carr 教授也對本研究作出重要貢獻。本工作得到了北大-清華生命科學聯(lián)合中心、科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委、蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室，以及生命科學學院儀器中心（成像平臺及流式平臺）的大力支持。

來源：北京大學