2021年10月28日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心伊成器教授課題組在Nature Chemical Biology雜志發(fā)表題為“Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs”的研究論文，開發(fā)了人源細(xì)胞中基于雙pegRNA的高效引導(dǎo)編輯新策略。

引導(dǎo)編輯（Prime Editing）可實(shí)現(xiàn)所有的12種堿基替換，還可以實(shí)現(xiàn)小片段堿基插入和刪除。引導(dǎo)編輯以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)，將nCas9（H840A）與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，獲得新的融合蛋白。此外，sgRNA的3’末端增加一段攜帶目標(biāo)突變的RNA序列，獲得的sgRNA被稱作pegRNA（prime editing guide RNA）。引導(dǎo)編輯理論上可以糾正多達(dá)89%的人類致病突變，但如何進(jìn)一步提高其效率和精準(zhǔn)度仍舊是一個(gè)挑戰(zhàn)。

本研究通過設(shè)計(jì)分別靶向DNA雙鏈的兩條pegRNA，對(duì)基因組的同一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行編輯，從而實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)編輯效率的提升。由于兩條pegRNA含有同源的3’末端，因此，該策略被命名為“HOPE”（HOmologous 3′ Extensions Mediated Prime Editor）。通過與原始引導(dǎo)編輯工具的一系列比較，證實(shí)HOPE在堿基替換、插入和刪除方面的效率顯著高于PE2，且副產(chǎn)物遠(yuǎn)少于PE3。此外，本研究探究了一系列影響HOPE效率的因素，包括DNA雙鏈上PAM之間的距離、PBS的長(zhǎng)度和退火值以及RT的長(zhǎng)度，提供了一套優(yōu)化的雙pegRNA設(shè)計(jì)原則。進(jìn)一步，本研究利用Cas-OFFinder軟件預(yù)測(cè)了pegRNA依賴型的脫靶區(qū)域，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增子靶向測(cè)序，證實(shí)了HOPE策略與原始引導(dǎo)編輯系統(tǒng)都具有很高的特異性。

HOPE策略的工作原理圖

綜上，本研究利用雙pegRNA策略，顯著提高了引導(dǎo)編輯的效率。通過在一系列內(nèi)源位點(diǎn)及不同細(xì)胞系上的驗(yàn)證，證實(shí)HOPE策略提供了效率與精準(zhǔn)度高度平衡的引導(dǎo)編輯新選擇。

伊成器為本文的通訊作者。生命科學(xué)學(xué)院博士生莊元、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士生劉江樂以及博士生烏浩為本文共同第一作者。生命科學(xué)學(xué)院本科生朱擎國(guó)、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士生閆永昌以及生命科學(xué)學(xué)院博士后孟浩巍對(duì)本文作出了重要貢獻(xiàn)。本文得到了北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳鵬教授的指導(dǎo)和支持。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。

來源：北京大學(xué)