RNA激活CRISPR/Cas14的反式ssDNA切割活性及其應(yīng)用。a.RNA觸發(fā)Cas14a1反式切割活性示意圖。b.ssDNA或RNA靶點(diǎn)的長(zhǎng)度(20 nt和50 nt)和突變替對(duì)觸發(fā)Cas14a1的反式切割活性的影響。c. ATCas-RNA平臺(tái)的工作原理。從感染的樣本中提取細(xì)菌16S rRNA，然后串聯(lián)DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，生成短RNA靶標(biāo)激活Cas14a1/的反式裂解活性。?海南大學(xué)供圖

近日，海南大學(xué)研究員萬(wàn)逸團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院院士李景虹團(tuán)隊(duì)共同在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》上發(fā)表論文《靶RNA激活CRISPR/Cas14a1進(jìn)行反式切割單鏈DNA而靶RNA自身不被降解》。該研究使CRISPR/Cas14a1系統(tǒng)具有診斷RNA單堿基錯(cuò)配的潛力，為開(kāi)發(fā)RNA單堿基診斷和成像技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

RNA是生物體重要的遺傳物質(zhì)，其堿基突變與各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此對(duì)早期生物體內(nèi)RNA堿基突變進(jìn)行診斷至關(guān)重要。目前，RNA堿基突變主要采用有熒光定量PCR、高通量測(cè)序、CRISPR/Cas酶法等檢測(cè)方法，由于CRISPR/Cas系統(tǒng)具有順式和反式切割的能力，可實(shí)現(xiàn)多種病原體的高靈敏度、定量、快速檢測(cè)，因此被廣泛應(yīng)用于RNA診斷。

當(dāng)前用于RNA堿基突變?cè)\斷多為CRISPR/Cas13a系統(tǒng)，其他CRISPR/Cas系統(tǒng)多需依賴(lài)結(jié)合其他方法進(jìn)行。因此，急需探索其他可直接用于區(qū)分RNA堿基突變的CRISPR/Cas系統(tǒng)。

據(jù)悉,該研究以激活底物靶ssDNA做對(duì)照，設(shè)計(jì)靶RNA激活CRISRP—Cas14a1反式切割的生化實(shí)驗(yàn)，包括靶RNA的長(zhǎng)度及缺失，sgRNA靶向片段的長(zhǎng)度及靶RNA單堿基突變等一系列試驗(yàn)。課題組發(fā)現(xiàn)，靶RNA（20nt）激活Cas14a1反式切割活性最好，3’端相比5’端缺失堿基對(duì)Cas14a1酶的反式切割活性影響更大；Cas14a1區(qū)分靶RNA單堿基錯(cuò)配能力要優(yōu)于靶ssDNA。

課題組利用靶RNA激活Cas14a1引發(fā)反式切割功能開(kāi)發(fā)出ATCas-RNA分析平臺(tái)，其對(duì)檢測(cè)16s RNA基因序列相近的病原微生物具有良好鑒定能力。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)25份實(shí)際樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)到100%。該技術(shù)的出現(xiàn)將有助于開(kāi)發(fā)新的RNA分析方法，有望成為一種強(qiáng)大的RNA臨床診斷工具。

相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1002/ange.202110384

來(lái)源：《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》