早在上世紀(jì)八九十年代，人們便觀察到細(xì)菌毒素刺激或細(xì)菌感染的巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生裂解性的細(xì)胞死亡(1, 2)，起初人們認(rèn)為這種細(xì)胞死亡是細(xì)菌主動(dòng)誘導(dǎo)產(chǎn)生以破壞宿主免疫系統(tǒng)的一種現(xiàn)象，是細(xì)菌毒力的體現(xiàn)，并將其誤認(rèn)為是“細(xì)胞凋亡”或者“壞死”。近年來(lái)隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到這是一種新型的由細(xì)胞自主控制的程序性死亡方式——焦亡（pyroptosis）。

脂多糖（lipopolysaccharide/LPS，又稱內(nèi)毒素）是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的關(guān)鍵成分，邵峰院士團(tuán)隊(duì)此前的工作表明人的caspase-4/5和小鼠中的同源蛋白caspase-11可識(shí)別胞質(zhì)中的LPS，發(fā)生自剪切依賴的激活，并進(jìn)一步切割活化GSDMD，GSDMD蛋白的N端結(jié)構(gòu)域寡聚并插入細(xì)胞膜打孔，從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生(3-6)<span “=”” style=”margin: 0px; padding: 0px; border: 0px; font-size: 12pt;”>。越來(lái)越多的證據(jù)表明，LPS–caspase-4/11–GSDMD通路所介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在宿主抵抗革蘭氏陰性病原菌的免疫防御中發(fā)揮著至關(guān)重要的(7)。

非經(jīng)典炎癥小體通路

志賀氏菌屬（Shigella，又稱痢疾桿菌）是引起人類細(xì)菌性痢疾（shigellosis）的常見(jiàn)病原菌，它能以極高的效率突破免疫防御并引起出血性腹瀉和嚴(yán)重的腸道炎癥。感染發(fā)生時(shí)，志賀菌會(huì)侵入宿主細(xì)胞，迅速逃離介導(dǎo)入侵的膜泡并在胞質(zhì)內(nèi)自由地生長(zhǎng)繁殖。作為一種革蘭氏陰性菌，這一特殊的生活方式不可避免地使其LPS暴露于caspase-4/11的免疫監(jiān)視之下。然而，caspase-4/11介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在抵抗志賀菌感染中所發(fā)揮的功能并不清楚。漫長(zhǎng)的共進(jìn)化過(guò)程中，志賀菌又是否獲得了對(duì)抗caspase-4/11的法寶呢？

2021年10月20日，北京生命科學(xué)研究所邵峰實(shí)驗(yàn)室和北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉小云實(shí)驗(yàn)室在 Nature 上合作發(fā)表了題為 Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11 的研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌（Shigella flexneri）通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白OspC3介導(dǎo)一種全新的翻譯后修飾來(lái)抑制caspase-4/11的功能，避免宿主細(xì)胞焦亡的發(fā)生，從而逃逸了這一重要的天然免疫防御機(jī)制對(duì)細(xì)菌的識(shí)別和清除。

研究伊始，邵峰實(shí)驗(yàn)室的研究人員發(fā)現(xiàn)，在給小鼠感染伯克霍爾德菌（也是一種在胞質(zhì)中生活的革蘭氏陰性病原菌）時(shí)，野生型小鼠可以存活下來(lái)，但Casp11敲除的小鼠很快就死亡了，確認(rèn)了caspase-11對(duì)于抵抗革蘭氏陰性菌的重要作用。然而非常意外的是，在志賀菌感染時(shí)，兩種小鼠卻沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異。

（左：感染志賀菌；右：感染伯克霍爾德菌）

作者通過(guò)體外細(xì)胞感染模型也發(fā)現(xiàn)，伯克霍爾德菌和沙門氏菌 （均為胞內(nèi)革蘭氏陰性菌）可以顯著激活caspase-4/11–GSDMD通路介導(dǎo)的焦亡，然而志賀菌感染時(shí)卻幾乎觀察不到這一現(xiàn)象。這提示志賀菌可能通過(guò)某種方式抑制了caspase-4/11–GSDMD通路的激活。

先前的研究表明，志賀菌可通過(guò)其三型分泌系統(tǒng)釋放一些效應(yīng)蛋白來(lái)抑制或影響宿主細(xì)胞的多種信號(hào)通路。作者對(duì)這些效應(yīng)蛋白進(jìn)行了分析和篩選，發(fā)現(xiàn)敲除了ospC3的志賀菌（S. f. ΔospC3）可顯著誘導(dǎo)caspase-4/11依賴的GSDMD的切割以及細(xì)胞焦亡的發(fā)生，提示志賀菌可能通過(guò)分泌OspC3來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

那么，OspC3是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用的呢？

首先，作者發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中外源表達(dá)OspC3即可抑制LPS誘導(dǎo)的GSDMD的切割以及細(xì)胞焦亡的發(fā)生，表明志賀菌感染時(shí)的確是分泌的OspC3本身抑制了caspase-4/11的功能，并且OspC3行使功能時(shí)不依賴于細(xì)菌中的其他因子。

進(jìn)一步地，作者發(fā)現(xiàn)OspC3可以與caspase-4/11發(fā)生相互作用。然而，將重組表達(dá)的OspC3與caspase-4/11進(jìn)行體外孵育時(shí)，OspC3并不能抑制caspase-4/11對(duì)GSDMD的切割，但將同樣的OspC3蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)的焦亡被抑制了。這表明OspC3不是簡(jiǎn)單地通過(guò)結(jié)合作用來(lái)抑制caspase-4/11的功能，而是需要細(xì)胞內(nèi)某種因子的參與才能發(fā)揮作用。

作者注意到，在SDS-PAGE凝膠上，與OspC3共表達(dá)的caspase-4遷移速率變慢，非變性膠上也可觀察到條帶位置發(fā)生顯著變化，這一數(shù)據(jù)表明，與OspC3共表達(dá)后，caspase-4/11蛋白上很可能發(fā)生了某種翻譯后修飾。

電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）和碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜（CID-MS）分析顯示，與OspC3共表達(dá)可使caspase-4/11的分子量增加524道爾頓（Da）。然而令人疑惑的是，524 Da的質(zhì)量與任何已知的翻譯后修飾都不匹配。

這一出乎意料的現(xiàn)象愈發(fā)激起了作者們的研究興趣。作者對(duì)發(fā)生修飾的肽段進(jìn)行二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了質(zhì)量與腺苷、單磷酸腺苷（AMP）和二磷酸腺苷（ADP）相匹配的離子。這讓作者聯(lián)想到了一種廣泛存在的翻譯后修飾：ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）。在這種修飾中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作為供體，其中的ADP-核糖（ADPR）基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到氨基酸殘基的側(cè)鏈上，使其分子量增加541 Da。

ADP-核糖基化示意圖（但今天的故事遠(yuǎn)沒(méi)有這么簡(jiǎn)單）

作者發(fā)現(xiàn)，在NAD⁺存在的情況下，純化的OspC3蛋白可在體外重組反應(yīng)中重現(xiàn)共表達(dá)條件下對(duì)caspase-4/11的修飾，這證明OspC3就是直接催化該翻譯后修飾的酶，并且這種修飾的供體也是NAD⁺。然而，OspC3介導(dǎo)的修飾比ADP-核糖基化小了17 Da （524 Da vs. 541 Da），證明這一修飾與ADP-核糖基化并不相同。

進(jìn)一步地，作者通過(guò)電子轉(zhuǎn)移/高能碰撞解離質(zhì)譜（EThcD-MS）分析發(fā)現(xiàn)，524 Da 的修飾分別發(fā)生在caspase-4 第314位或caspase-11第310位的精氨酸殘基上 （R314/R310），將R314/R310突變?yōu)橘嚢彼峄蛱於０泛?，修飾不再發(fā)生。

至此，一個(gè)嶄新的科學(xué)問(wèn)題擺在作者面前：利用NAD⁺作為供體，如何給精氨酸殘基加上524 Da的修飾？

通過(guò)分析多種NAD⁺ 類似物進(jìn)行體外修飾反應(yīng)的結(jié)果，作者證明，NAD⁺中的ADP-核糖基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到了底物蛋白上，同時(shí)釋放了煙酰胺，定量的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）分析也證明修飾反應(yīng)的確釋放了煙酰胺。這與已知的ADP-核糖基化的過(guò)程一致。那么，減小的17 Da源自何處呢？從分子量上分析，減小17 Da很可能是由于發(fā)生了脫氨反應(yīng)，而可能的脫氨位點(diǎn)只有兩個(gè)：腺苷上的氨基和精氨酸側(cè)鏈的氨基。

首先，作者檢測(cè)了修飾反應(yīng)后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)的確產(chǎn)生了氨。作者又利用一種焦磷酸鍵水解酶NUDT16與修飾后的caspase-4反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)成功地從修飾中去除了一個(gè)完整的AMP基團(tuán)，證明在該修飾中AMP部分是保持不變的，這也表明脫去的氨基應(yīng)該就是精氨酸側(cè)鏈的氨基。的確，利用已經(jīng)脫氨的NAD⁺（Deamino-NAD⁺）進(jìn)行修飾反應(yīng)時(shí)，從分子量變化分析也存在脫氨反應(yīng)。至此，一切證據(jù)都指向精氨酸側(cè)鏈在修飾中發(fā)生了脫氨。如何才能直接證明這一點(diǎn)呢？作者創(chuàng)造性地利用穩(wěn)定同位素氨基酸標(biāo)記 （SILAC）結(jié)合質(zhì)譜分析的方法，發(fā)現(xiàn)修飾后的精氨酸殘基失去了一個(gè)氮原子（N），為精氨酸殘基上發(fā)生的脫氨反應(yīng)找到了直接證據(jù)。至此，作者證明了OspC3介導(dǎo)的修飾反應(yīng)實(shí)質(zhì)上由精氨酸殘基的ADP-核糖基化和脫氨組合而成（+541-17 = 524 Da）。

那么這個(gè)脫氨反應(yīng)是如何發(fā)生的呢？從化學(xué)角度分析，脫氨需要一個(gè)靠近精氨酸側(cè)鏈的親核基團(tuán)發(fā)動(dòng)進(jìn)攻，使氨基離去。作者推測(cè)核糖基團(tuán)的2’-OH可能扮演了這一角色，于是他們合成了2’-OH被氫原子替代的 NAD⁺類似物 （2’-Deoxy-2’-H-NAD⁺），并用其進(jìn)行了體外修飾反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2’-OH親核基團(tuán)的喪失，使修飾反應(yīng)停留在ADP-脫氧核糖基化，不再能發(fā)生脫氨。所以，在OspC3介導(dǎo)的修飾中，核糖基團(tuán)的2’-OH發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻取代了精氨酸側(cè)鏈的氨基。

然而，此時(shí)的信息依然不足以明確這種修飾的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因?yàn)槔碚撋暇彼醾?cè)鏈的三個(gè)N都可以接收ADP-核糖基團(tuán)，而ADP-核糖基化發(fā)生的位置決定了這個(gè)修飾最終的化學(xué)結(jié)構(gòu)。為了得到準(zhǔn)確的答案，作者利用一種小分子茚三酮 （ninhydrin）可以與精氨酸側(cè)鏈末端氮原子發(fā)生反應(yīng)的特性，證明了δ位的氮原子（N^δ）接收了ADP-核糖基團(tuán)。

通過(guò)一系列設(shè)計(jì)精妙的生化實(shí)驗(yàn)和嚴(yán)密的邏輯推理，作者最終發(fā)現(xiàn)OspC3通過(guò)催化兩步親核取代反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)利用NAD⁺對(duì)caspase-4/11-R314/R310的共價(jià)修飾（建議感興趣的讀者閱讀原文）。首先，精氨酸上的N^δ對(duì)NAD⁺中的煙酰胺進(jìn)行親核取代，這與目前已知的精氨酸ADP-核糖基化（發(fā)生在N^ω上）是不同的。隨后，ADP-核糖基團(tuán)的ribosyl-2’-OH被活化，進(jìn)攻精氨酸側(cè)鏈末端胍基的碳原子，引發(fā)脫氨反應(yīng)，從而在脫去一個(gè)氨基的精氨酸和ADP-核糖基團(tuán)之間形成一個(gè)惡唑烷環(huán) （oxazolidine）的共價(jià)連接結(jié)構(gòu)。作者將這種全新的修飾命名為ADP-riboxanation，并據(jù)此將OspC3的活性定義為精氨酸ADP-riboxanase。

那么，為何發(fā)生了ADP-riboxanation的caspase-4/11不再能介導(dǎo)細(xì)胞焦亡呢？

作者發(fā)現(xiàn)，OspC3首先阻斷了LPS誘導(dǎo)的caspase-4/11的自切割，從而抑制了caspase-4/11的活化。此外， OspC3也可以對(duì)已經(jīng)活化的caspase-4/11進(jìn)行修飾，從而干擾caspase-4與GSDMD的結(jié)合位點(diǎn)，使其不再能與GSDMD形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合體。修飾后的caspase-4/11失去了結(jié)合和切割GSDMD的能力，同時(shí)也失去了切割其最適多肽底物的能力。通過(guò)對(duì)caspase家族的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，作者發(fā)現(xiàn)修飾發(fā)生的R在所有caspase家族成員中都是保守的，將caspase-4/11 的 R314/310突變?yōu)橘嚢彼?、丙氨酸或谷氨酸均可使其失活?strong>因此，R314/310 ADP-riboxanation破壞了caspase-4/11蛋白酶關(guān)鍵位點(diǎn)的生化特性，使它們喪失了基本的切割多肽的功能。

研究清楚對(duì)底物caspase-4/11的修飾機(jī)制后，作者又將目光轉(zhuǎn)回到酶本身——作為精氨酸ADP-riboxanase，OspC3是如何識(shí)別底物蛋白并發(fā)揮功能的呢？

福氏志賀菌共編碼三個(gè)OspC家族蛋白：OspC1、OspC2和OspC3。盡管這三個(gè)蛋白的序列一致性超過(guò)60%，但與OspC3不同的是，OspC1/2幾乎不修飾caspase-4，也不能抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡?；谛蛄蟹治龅慕Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明它們均包含一個(gè)位于C端的ankyrin repeats domain（ARD，介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用）和一個(gè)未知功能的N端結(jié)構(gòu)域。

作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，OspC3的ARD，而不是OspC1/2的ARD，能夠與caspase-4發(fā)生相互作用。將OspC3的ARD替換為OspC1/2的ARD，幾乎完全去除了其對(duì)caspase-4的修飾功能。相反，將Ospc1/2的ARD 替換為OspC3的ARD后，它們也可以高效地修飾caspase-4并抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。因此，OspC3的ARD結(jié)構(gòu)域決定了其對(duì)底物caspase-4/11的識(shí)別，并且提示OspC家族蛋白都具備保守的ADP-riboxanase活性，并以ARD結(jié)構(gòu)域的多樣性實(shí)現(xiàn)對(duì)不同底物蛋白的選擇。

作者通過(guò)大量的突變篩選發(fā)現(xiàn)了多個(gè)OspC3發(fā)揮修飾功能的關(guān)鍵殘基，均位于其N端的酶活結(jié)構(gòu)域內(nèi)且在OspC家族中高度保守。值得一提的是，D177A的突變導(dǎo)致OspC3介導(dǎo)的修飾停留在ADP-核糖基化，阻止了隨后的脫氨反應(yīng)，這對(duì)上文中經(jīng)推理分析得出的兩步親核取代的反應(yīng)機(jī)制提供了強(qiáng)有力的佐證。D177A-OspC3介導(dǎo)的修飾可被細(xì)胞中的精氨酸ADP-核糖基水解酶去除，但ADP-riboxanation抵抗了所有已知的ADP-核糖基水解酶的去修飾作用。因此，通過(guò)ADP-riboxanation來(lái)抑制caspase-4/11對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)更為有利。

（上：ADP-riboxanation；下：ADP-ribosylation）

最后，作者回到動(dòng)物模型上，對(duì)OspC3在志賀菌感染過(guò)程中的生物學(xué)意義進(jìn)行了更加深入的解析。

作者發(fā)現(xiàn)，在野生型志賀菌致死劑量的感染條件下，野生型小鼠在感染OspC3活性缺失的菌株后可以存活。然而，Casp11敲除小鼠對(duì)野生型和ospC3敲除的菌株同樣敏感。對(duì)小鼠器官的細(xì)菌負(fù)荷量進(jìn)行檢測(cè)也得到了類似的結(jié)論。這些結(jié)果表明Ospc3介導(dǎo)的caspase-11的失活在志賀菌逃逸宿主免疫防御中具有關(guān)鍵作用。

值得注意的是，與感染野生型志賀菌的小鼠相比，感染ospC3敲除菌株的小鼠產(chǎn)生了更多抗志賀菌的抗體，且在面臨再次感染時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力，而這一現(xiàn)象在Casp11或Gsdmd敲除的小鼠中并不存在。這一發(fā)現(xiàn)揭示了caspase-11介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡對(duì)激活適應(yīng)性免疫也起一定作用。據(jù)此，作者發(fā)現(xiàn)ospC3的敲除可以作為一種潛在的志賀菌減毒活疫苗的開(kāi)發(fā)策略。

最后，作者還發(fā)現(xiàn)OspC家族蛋白在多種細(xì)菌中存在，這提示ADP-riboxanation修飾可能被廣泛應(yīng)用于多種生物學(xué)場(chǎng)景。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)了一種由OspC家族蛋白介導(dǎo)的新型翻譯后修飾——精氨酸ADP-riboxanation。志賀菌分泌效應(yīng)蛋白OspC3對(duì)caspase-4/11的R314/310進(jìn)行修飾，阻斷了caspase-4/11的活化及其對(duì)GSDMD的切割，抑制了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而逃逸了caspase-4/11–GSDMD所介導(dǎo)的宿主抗胞內(nèi)革蘭氏陰性菌的免疫機(jī)制。該研究不僅揭示了志賀菌——這一重要的腸道病原菌如何逃逸宿主的天然免疫系統(tǒng)，也開(kāi)辟了蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域一個(gè)全新的研究方向，堪稱邵峰團(tuán)隊(duì)在宿主和病原菌相互作用領(lǐng)域又一里程碑式的工作。

邵峰實(shí)驗(yàn)室李子霖博士為本文第一作者。邵峰實(shí)驗(yàn)室劉旺博士，劉小云實(shí)驗(yàn)室付嘉琦博士以及中科院生物物理所丁璟珒博士亦為本工作做出重要貢獻(xiàn)。論文的其他作者還包括程森博士，許悅博士，王志強(qiáng)，劉筱璠，史旭焱，劉亞鑫和齊湘兵博士。邵峰博士和劉小云博士為本文共同通訊作者。該研究由科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，中科院戰(zhàn)略先導(dǎo)科技專項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金，以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程資助，在北京生命科學(xué)研究所完成。

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來(lái)源：NIBS