三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、腺苷（Adenosine，Ado）等嘌呤類(lèi)分子細(xì)胞內(nèi)外廣泛存在。胞內(nèi)的嘌呤類(lèi)分子主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞能量代謝等過(guò)程；而胞外的嘌呤類(lèi)分子則作為信號(hào)分子（被稱(chēng)為“嘌呤類(lèi)遞質(zhì)”），通過(guò)作用在其相應(yīng)受體調(diào)節(jié)呼吸調(diào)控、味覺(jué)感受、睡眠等生理活動(dòng)；嘌呤類(lèi)遞質(zhì)及其受體還參與調(diào)節(jié)癲癇、疼痛、炎癥反應(yīng)、腦外傷和缺血等病理狀態(tài)。此外，嘌呤能信號(hào)失調(diào)還與抑郁、精神分裂癥等精神類(lèi)疾病密切相關(guān)。迄今，解密嘌呤能信號(hào)傳遞功能的一大技術(shù)瓶頸是缺乏靈敏、特異且非侵入性的工具，以高時(shí)空分辨率地報(bào)告嘌呤類(lèi)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。

2021年12月22日，北京大學(xué)李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Neuron雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，報(bào)道了新型基因編碼的ATP探針GRAB_ATP1.0的開(kāi)發(fā)和在體外及活體動(dòng)物的應(yīng)用。李毓龍實(shí)驗(yàn)室自2018年以來(lái)，先后開(kāi)發(fā)了針對(duì)乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷、五羥色胺、內(nèi)源大麻素等神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)的熒光探針，此次發(fā)表的GRABATP1.0是其又一力作，進(jìn)一步擴(kuò)展了GRAB系列熒光探針家族。

論文截圖

在這一工作中，李毓龍實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用其先前設(shè)計(jì)的GRAB探針策略（GPCR Activation-Based sensor)，基于人源ATP受體P2Y₁和循環(huán)重排的綠色熒光蛋白cpEGFP開(kāi)發(fā)了ATP探針GRAB_ATP1.0（簡(jiǎn)稱(chēng)為ATP1.0）。在體外培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞、原代神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中，ATP1.0探針均表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞膜定位。神經(jīng)元表達(dá)的ATP1.0對(duì)外源加入的ATP及ADP有~780%的信號(hào)響應(yīng)、~80 nM的親和力（EC₅₀），及高度的分子特異性（圖1）。此外，ATP1.0能夠在亞秒級(jí)別響應(yīng)胞外ATP濃度的變化。

圖1：ATP1.0在HEK293T細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元上的表現(xiàn)

ATP1.0探針能否用來(lái)檢測(cè)內(nèi)源釋放的ATP呢？作者從原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞入手，發(fā)現(xiàn)ATP1.0能夠檢測(cè)到機(jī)械刺激及低滲透壓刺激引發(fā)的ATP釋放，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)及突變型探針實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了ATP1.0檢測(cè)信號(hào)的特異性（圖2）。有意思的是，在不給予額外刺激時(shí)，ATP1.0也能靈敏地記錄到直徑約為30微米的自發(fā)性ATP釋放事件，表明ATP的釋放具有化學(xué)分子特異和空間特異性。

圖2：ATP1.0在原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞中檢測(cè)內(nèi)源ATP的釋放

ATP1.0探針能否在活體動(dòng)物加以運(yùn)用呢？過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，胞內(nèi)毫摩爾級(jí)別的ATP被釋放胞外，作為“危險(xiǎn)信號(hào)”被周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞感受，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放趨化因子等，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的嘌呤類(lèi)受體在小膠質(zhì)細(xì)胞激活、遷移及分泌信號(hào)因子過(guò)程中發(fā)揮重要作用。那么，在這一過(guò)程中，信號(hào)分子ATP的傳播和小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移是如何動(dòng)態(tài)并變化的？作者將ATP1.0探針表達(dá)在斑馬魚(yú)中，通過(guò)激光照射引發(fā)局部損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)ATP的釋放呈現(xiàn)“波狀”傳播；通過(guò)將綠色ATP1.0探針表達(dá)在紅色熒光蛋白標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，能夠直觀地檢測(cè)到隨著ATP信號(hào)的傳播小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移過(guò)程（圖3上）。

圖3：ATP1.0報(bào)告斑馬魚(yú)受到局部損傷時(shí)及小鼠發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)大腦中的胞外ATP信號(hào)

當(dāng)大腦處于疾病狀態(tài)時(shí)，ATP的釋放又會(huì)呈現(xiàn)什么樣的變化？如上所述，嘌呤能信號(hào)在免疫中扮演著重要角色。為了檢測(cè)免疫反應(yīng)過(guò)程中大腦中ATP信號(hào)的變化，作者通過(guò)腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的方式引發(fā)小鼠的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)AAV病毒介導(dǎo)的方法將ATP1.0表達(dá)在小鼠的大腦皮層，并借助雙光子成像記錄ATP的信號(hào)。有意思的是，LPS注射后，小鼠大腦皮層呈現(xiàn)出強(qiáng)烈、但空間特異的ATP信號(hào)上升現(xiàn)象（見(jiàn)視頻）。

視頻：腹腔注射LPS的小鼠炎癥模型中大腦皮層ATP信號(hào)的變化，注意局部ATP釋放的信號(hào)

除了開(kāi)發(fā)高靈敏的ATP1.0探針外，作者還開(kāi)發(fā)了反應(yīng)動(dòng)力學(xué)更快及親和力更低的ATP探針ATP1.0-L。在神經(jīng)元中表達(dá)的ATP1.0-L對(duì)胞外的ATP的親和力（EC₅₀）約為32 μM。當(dāng)在原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞及活體的斑馬魚(yú)中表達(dá)，ATP1.0-L均能檢測(cè)到更加局部的ATP信號(hào)。

綜上所述，在這項(xiàng)工作中作者開(kāi)發(fā)了新型遺傳編碼的ATP熒光探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞外ATP的高時(shí)空分辨率的記錄。在此之前，李毓龍課題組在2020年還開(kāi)發(fā)了另外一種嘌呤類(lèi)遞質(zhì)腺苷的GRAB熒光探針，并助力中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心徐敏團(tuán)隊(duì)在睡眠調(diào)控中的研究。相信一系列新型成像工具的開(kāi)發(fā)，將助力科學(xué)家更加深入地研究嘌呤能信號(hào)傳遞在生理和病理?xiàng)l件下的功能和調(diào)控機(jī)理。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后武照伐為本文第一作者，李毓龍教授和武照伐博士為共同通訊作者，本科畢業(yè)生何凱凱、博士研究生潘孫磊、李柏翰、鄧飛和王歡等對(duì)文章作出了重要貢獻(xiàn)。北大研究團(tuán)隊(duì)與北京腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心井淼團(tuán)隊(duì)（陳閱、席鳳雪）及中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心杜久林團(tuán)隊(duì)（李紅羽、劉亭亭）等展開(kāi)通力合作，該工作得到了北京大學(xué)膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市科委、峰基金及勃林格殷格翰博士后獎(jiǎng)學(xué)金等機(jī)構(gòu)和經(jīng)費(fèi)的大力支持。

來(lái)源：北京大學(xué)